中國簾蛤目16種經(jīng)濟(jì)貝類DNA條形碼及分子系統(tǒng)發(fā)育的研究

王琳楠,閆喜武,秦艷杰,聶鴻濤,牛泓博,張國范

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心,遼寧大連116023;2.中國科學(xué)院海洋研究所海洋生物技術(shù)研發(fā)中心,山東青島266071)

中國簾蛤目16種經(jīng)濟(jì)貝類DNA條形碼及分子系統(tǒng)發(fā)育的研究

王琳楠1,閆喜武1,秦艷杰1,聶鴻濤1,牛泓博1,張國范2

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心,遼寧大連116023;2.中國科學(xué)院海洋研究所海洋生物技術(shù)研發(fā)中心,山東青島266071)

對(duì)中國簾蛤目主要經(jīng)濟(jì)貝類的分子系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了研究,應(yīng)用DNA條形碼通用引物擴(kuò)增了6種中國近海簾蛤目經(jīng)濟(jì)貝類共計(jì)60個(gè)個(gè)體的COI基因片段,與GenBank收錄的10種簾蛤目貝類50條同源序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明:簾蛤目貝類COI基因存在堿基插入和缺失現(xiàn)象,在16個(gè)物種中有6個(gè)物種存在103個(gè)插入和缺失位點(diǎn),其中雜色蛤仔Ruditapes variegata、裂紋哥特蛤Katelysia hiantina插入和缺失位點(diǎn)均為30個(gè),大竹蟶Solen grandis為27個(gè);堿基的組成出現(xiàn)偏倚現(xiàn)象,A+T含量 (64.2%)明顯高于G+C含量(35.8%);基于K2P模型的計(jì)算,16個(gè)物種的種內(nèi)平均遺傳距離為0.010 6,種間平均遺傳距離為0.388 4,后者是前者的21.34倍;系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析表明,COI基因在科、屬、種水平上的鑒定及其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系重構(gòu)方面與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類一致性較高。研究表明,線粒體COI基因作為簾蛤目貝類DNA條形碼在物種鑒定的適用性上提供了一定的依據(jù),同時(shí)也為形態(tài)分類系統(tǒng)提供了必要補(bǔ)充。

簾蛤目;COI基因;系統(tǒng)發(fā)育;分類鑒定;DNA條形碼

簾蛤目Veneroida隸屬于軟體動(dòng)物門Mollusca、雙殼綱Bivalvia,是世界上分布較廣的貝類[1]。中國的簾蛤目貝類種類豐富,已有記錄的近千種,若僅僅依據(jù)殼型、放射肋、小月面等外部形態(tài)特征進(jìn)行種屬水平的形態(tài)學(xué)分類難度很大[2-3],需要以基于分子生物學(xué)的分析方法進(jìn)行補(bǔ)充。DNA條形碼技術(shù) (DNA barcoding)是利用COI基因構(gòu)建物種的鑒別體系[4-5],現(xiàn)已成為物種鑒定的一門新興技術(shù)。DNA條形碼的兩大主要目的是鑒定已知種和發(fā)現(xiàn)新種,它相對(duì)于傳統(tǒng)的生物鑒定的優(yōu)勢(shì)就是可以揭示隱存種。近年來,COI基因序列已經(jīng)廣泛應(yīng)用于貝類的種質(zhì)鑒定[6-10]、 種群遺傳結(jié)構(gòu)分析[11-13]、分子系統(tǒng)發(fā)生研究[14-21]等領(lǐng)域。 研究證實(shí),COI基因序列適用種內(nèi)、種間和屬以上階元的遺傳多樣性分析[22-25]。本研究中以中國黃渤海、東海、南海16種重要的簾蛤目經(jīng)濟(jì)貝類為材料,由于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定一般都是根據(jù)殼形、鉸合部和閉殼肌痕等形態(tài)特征來進(jìn)行鑒定,而實(shí)際上殼形的多變以及發(fā)育中存在的中間形態(tài)和中間生境,使得形態(tài)學(xué)分類比較困難,為此本研究基于COI序列的DNA條形碼技術(shù)對(duì)這些貝類進(jìn)行分析,從而證明DNA條形碼在簾蛤目貝類輔助物種鑒定中的適用性,旨在為全球貝類DNA條形碼數(shù)據(jù)庫提供可靠的資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用60個(gè)簾蛤目樣品均采自中國沿海地區(qū),參照 《中國海產(chǎn)雙殼類圖志》進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,這些樣品隸屬于4科、5屬、6種,分別為櫻蛤科亮櫻蛤?qū)?種、竹蟶科竹蟶屬2種、簾蛤科畸心蛤?qū)?種、簾蛤科鏡蛤?qū)?種、綠螂科綠螂屬1種。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 從GenBank 中篩選出已經(jīng)發(fā)表的簾蛤目COI基因序列信息50條,分別屬于簾蛤目3科、9屬、10種,共選取簾蛤目16個(gè)種, 110個(gè)個(gè)體進(jìn)行研究。選取長牡蠣為外類群 (表 1)。試驗(yàn)時(shí)每個(gè)種取10～12個(gè),取其斧足、閉殼肌或者外套膜約50 mg,采用酚氯仿法抽提DNA。DNA溶于TE中,于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 16種簾蛤目貝類的COI基因信息Tab.1 Information of COI genes in 16 species in Veneroida

1.2.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序 COI片段采用無脊椎動(dòng)物通用的COI引物序列LCO1490(5＇GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 3＇)和 HC02198 (5＇TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 3＇)[26]。引物由英濰捷基 (上海)貿(mào)易有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,由Invitrogen(上海)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用 Clustal X 1.81軟件進(jìn)行序列比對(duì)排序[27],經(jīng)DnaSP 4.0[28]單倍型分析后,將單倍型序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫。利用Mega 4.0軟件統(tǒng)計(jì)不同樣本的核苷酸組成、突變位點(diǎn)、遺傳距離、轉(zhuǎn)換/顛換值[18,29];利用DnaSP 4.0計(jì)算單倍型數(shù)量、單倍型多態(tài)性、核苷酸多樣性指數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù),以及插入和缺失位點(diǎn)數(shù);使用Mega 4.0中的Kimura雙參數(shù)法(K2P)計(jì)算種內(nèi)和種間的遺傳距離,并構(gòu)建基于K2P的鄰接樹(neighbor joining, NJ)和最大簡約樹(maximum parsimony,MP)[30]。

2 結(jié)果

2.1 簾蛤目COI序列分析

本研究中,對(duì)6種簾蛤目的COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,挑選較好的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,經(jīng)過比對(duì)和校正后提交GenBank數(shù)據(jù)庫,得到的登錄號(hào)見表1。將研究中測(cè)定及下載的所有COI序列進(jìn)行整理,并裁剪為同一長度628 bp進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,在研究的110個(gè)個(gè)體中共產(chǎn)生了56個(gè)單倍型,單倍型多態(tài)性指數(shù)為0.533 0～1.000 0;核苷酸多態(tài)性指數(shù)為0.001 07～0.088 04;在16個(gè)物種 (GP1～GP16)中有6個(gè)物種存在堿基插入和缺失現(xiàn)象,占到了37.50%,共存在103個(gè)插入和缺失位點(diǎn) (表2)。

表2 16種簾蛤目貝類的COI基因序列特征Tab.2 The characters of COI sequences from 16 species in Veneroida

110條簾蛤目貝類COI序列的平均堿基組成: T為 41.4%,C為 14.3%,A為 22.8%,G為21.4%,其中A+T的含量 (64.2%)明顯高于G+ C的含量 (35.8%),堿基出現(xiàn)明顯的偏倚性,符合線粒體堿基組成的特點(diǎn) (表3)。

表3 16種簾蛤目貝類的COI序列堿基組成的頻率Tab.3 Average nucleotide frequencies of COI sequences in 16 species in Veneroida %

本研究中的110條簾蛤目COI序列的核苷酸變異情況如表4所示。

2.2 種內(nèi)和種間的遺傳距離

基于K2P算法計(jì)算出110個(gè)個(gè)體的簾蛤目COI基因序列的種內(nèi)和種間遺傳距離如表5所示。16個(gè)物種的種內(nèi)平均遺傳距離為0.010 6,56.25%的種內(nèi)遺傳距離小于0.010 0,其中裂紋哥特蛤的種內(nèi)遺傳距離最大,為0.018 2,并未超出DNA條形碼COI基因種類遺傳距離2%的界限。

表4 16種簾蛤目貝類的COI部分序列密碼子的變異Tab.4 The variation in some codons of COI gene sequences of 16 species in Veneroida

2.3 簾蛤目的分類及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

從基于NJ法和MP法構(gòu)建的簾蛤目系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)可見,用兩種方法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹得到相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),但對(duì)不同分類階元而言,分子系統(tǒng)關(guān)系與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類結(jié)果不盡相同。在種水平上,NJ樹和MP樹的分類一致性均為100%;在屬水平上,分子系統(tǒng)與形態(tài)學(xué)的分類結(jié)果略有差異。

表5 16種簾蛤目貝類的種間和種內(nèi)遺傳距離Tab.5 Genetic distances in intraspecific and interspecies in 16 species in Veneroida

圖1 基于NJ法和MP法構(gòu)建的簾蛤目系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 NJ and MP trees based on COI gene data from Veneroida

3 討論

3.1 簾蛤目線粒體COI基因的結(jié)構(gòu)特征

本研究結(jié)果表明,在簾蛤目16個(gè)物種中有6個(gè)物種COI基因存在堿基插入和缺失現(xiàn)象,占到了37.50%。共存在103個(gè)插入和缺失位點(diǎn),其中雜色蛤仔、裂紋哥特蛤插入和缺失位點(diǎn)均多達(dá)30個(gè),大竹蟶插入和缺失位點(diǎn)為27個(gè)。堿基的插入和缺失現(xiàn)象在軟體動(dòng)物中較為常見[31-36],這可能與軟體動(dòng)物進(jìn)化過程中線粒體拷貝數(shù)的變化有一定關(guān)聯(lián)。簾蛤目貝類COI基因堿基組成中也存在著很普遍的偏倚現(xiàn)象。朱立靜等[37]對(duì)四角蛤蜊COI基因的研究表明,四角蛤蜊的A+T含量明顯高于G+C含量;程漢良等[38]對(duì)簾蛤目中6種貝類進(jìn)行COI序列的擴(kuò)增結(jié)果也表明,A+T含量明顯高于G+C含量。這與本研究結(jié)果相似。線粒體堿基組成的偏倚現(xiàn)象符合無脊椎動(dòng)物線粒體基因組的特點(diǎn),其他無脊椎動(dòng)物如蝦、蟹、頭足類等均存在這種相似的現(xiàn)象[39]。

COI基因存在著大量序列變異,適于用其進(jìn)行群體遺傳學(xué)多樣性分析。在線粒體序列變異中,變異位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換較易在近緣種間頻繁發(fā)生,而顛換在較遠(yuǎn)緣種間頻繁發(fā)生;在同種動(dòng)物中,轉(zhuǎn)換往往在數(shù)量上遠(yuǎn)超過顛換。本研究中的物種分別屬于不同種屬關(guān)系,故顛換多于轉(zhuǎn)換。

3.2 DNA條形碼與形態(tài)學(xué)方法在簾蛤目貝類物種鑒定中的異同

DNA條形碼對(duì)物種的鑒定可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定存在的不足,為形態(tài)學(xué)鑒定提供充足的理論依據(jù)[26]。徐鳳山[1]用形態(tài)學(xué)鑒定方法,將本研究中的16個(gè)種分成了6科,其中簾蛤科有菲律賓蛤仔、雜色蛤仔、畸心蛤、江戶布目蛤、日本鏡蛤、文蛤、青蛤、綴錦蛤、巴非蛤和裂紋哥特蛤;蛤蜊科有四角蛤蜊;櫻蛤科有虹光亮櫻蛤;綠螂科有中國綠螂;竹蟶科有大竹蟶和長竹蟶;截蟶科有縊蟶。本研究中構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹在科水平上與用形態(tài)學(xué)方法鑒定的一致性為83.3%,其中虹光亮櫻蛤與中國綠螂分別屬于不同的科,卻聚為一支,而在MP樹中則不存在這個(gè)問題;在屬水平上,相同屬的種類可以很好地聚為一支,一致性為100%。本研究中發(fā)現(xiàn),青蛤與文蛤聚為一支,綴錦蛤、巴非蛤與裂紋哥特蛤聚為一支,大竹蟶、長竹蟶與縊蟶聚為一支,這可以說明他們之間的親緣關(guān)系較近,這與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相符合[1],這樣就為以往的形態(tài)學(xué)分類增加了可靠的依據(jù)。

3.3 DNA條形碼在簾蛤目貝類物種鑒定中的適用性和局限性

本研究中所開發(fā)的全部條形碼序列逐一與生物條形碼數(shù)據(jù)庫 (BoLD)中已經(jīng)公布的生物條形碼進(jìn)行比對(duì),匹配率高達(dá)100%,并與形態(tài)學(xué)鑒定相吻合,表明DNA條形碼在簾蛤目貝類鑒定方面具有較高的適用性,完全可以通過COI基因序列的對(duì)比完成物種的準(zhǔn)確鑒定。同時(shí)Hebert等[26]對(duì)動(dòng)物界11個(gè)門13 320個(gè)物種的COI基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其序列間的差異能夠很好地區(qū)分所有研究物種,并認(rèn)為在動(dòng)物界中COI基因是合適的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因。Vences等[40]于 2005年探討了DNA條形碼對(duì)兩棲爬行類物種的鑒定能力,結(jié)果顯示選用的COI基因能夠準(zhǔn)確辨別各物種。此外Vences等[40]選用16S rRNA基因進(jìn)行條形碼分析,發(fā)現(xiàn)在兩棲爬行類中16S rRNA基因具有較強(qiáng)的引物適應(yīng)性,并且序列相對(duì)保守。對(duì)于國際上分類混亂的兩棲爬行類,使用DNA條形碼技術(shù),不僅能夠準(zhǔn)確地鑒別出各物種,而且還能準(zhǔn)確無誤地識(shí)別出其不同地理類群的變異。對(duì)北美哥斯達(dá)黎加地區(qū)1 000多種鱗翅目昆蟲生物多樣性的調(diào)查中,Hajibabaei等[41]利用DNA條形碼的COI基因序列建立了一個(gè)分類學(xué)平臺(tái),能夠鑒定物種以及發(fā)現(xiàn)這一區(qū)域存在的模糊種,并且能準(zhǔn)確鑒定97%的物種,區(qū)分不能被確認(rèn)的物種是親緣關(guān)系極近的物種或形態(tài)定義模糊的物種,由此認(rèn)為,DNA條形碼能夠很好地協(xié)助進(jìn)行一個(gè)地區(qū)的生物多樣性調(diào)查。Hebert等[26]利用COI基因序列對(duì)北美260余種鳥類進(jìn)行了有效區(qū)分。利用DNA條形碼也能夠?qū)︳~類以及熱帶鱗翅目昆蟲進(jìn)行有效的物種鑒別。

Hebert等[26]指出,利用COI序列有效地進(jìn)行物種鑒別的關(guān)鍵是種間的遺傳距離必須大于種內(nèi)的遺傳距離。Hebert等[26]在對(duì)動(dòng)物界11個(gè)門13 320個(gè)物種進(jìn)行研究后得出,物種種內(nèi)的遺傳距離很少有大于2%的,大部分物種種內(nèi)遺傳距離小于1%。本研究結(jié)果表明,16種簾蛤目貝類種間的平均遺傳距離為0.388 4,種內(nèi)平均遺傳距離為0.010 6,種間平均遺傳距離為種內(nèi)平均遺傳距離的21.34倍;而種內(nèi)遺傳距離介于0.002 3～0.018 2,均小于2%,與Herbert等提出的觀點(diǎn)相符。

COI適用于物種鑒定的原因在于COI基因既保證了足夠多變異的同時(shí)又很容易被通用引物進(jìn)行擴(kuò)增,而且發(fā)生插入和缺失的也是很小的一部分序列,甚至不會(huì)發(fā)生插入和缺失現(xiàn)象。本研究中發(fā)現(xiàn)簾蛤目的貝類有一些堿基插入和缺失現(xiàn)象,孔曉瑜等[42]的研究發(fā)現(xiàn),魁蚶也存在堿基的插入和缺失現(xiàn)象。而且這種插入和缺失的現(xiàn)象普遍存在于其他各種動(dòng)物體中。

雖然基于COI基因的DNA條形碼可以較好地實(shí)現(xiàn)物種的鑒定,但DNA條形碼仍存在一定的缺陷,不可以完全取代形態(tài)學(xué)方法在分類學(xué)上的地位。DNA介導(dǎo)的物種鑒定重點(diǎn)在于種內(nèi)和種間遺傳差異的限定。種內(nèi)和種間變異范圍都不明確,而且不同物種的變異范圍也不相同。就線粒體DNA而言,種內(nèi)差異通常小于種間差異,但也有一些特例[34]。由于不同的種系間線粒體基因的水平轉(zhuǎn)移,近緣物種共享線粒體多態(tài)性以及同屬物種間的線粒體DNA修剪機(jī)制,都將造成快速分化物種與通過雜交產(chǎn)生的新物種在鑒定上的困難。本研究結(jié)果表明,DNA條形碼在簾蛤目貝類的鑒定中有一定的適用性,但仍有許多問題需要解決。

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DNA barcoding and molecular phylogeny of 16 species of economical shellfish in Veneroida along China Coast

WANG Lin-nan1,YAN Xi-wu1,QIN Yan-jie1,NIE Hong-tao1,NIU Hong-bo1,ZHANG Guo-fan2
(1.Engineering Research Center of Shellfish Culture and Breeding in Liaoning Province,College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Research and Development Center of Marine Biotechnology,Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071,China)

Mitochondrial COI genes were sequenced from 60 individuals of 6 common species in Veneroida along China coast using the universal barcoding primers,and the 60 sequences were compared with the other 50 homologous sequences from 10 shellfish species in Veneroida derived from the GenBank.The results showed that there were Insert-Deletion(indel)sites in many COI sequences in Veneroida species,total indel siteswere 103,including COI sequence indels of up to 30 for Manila clamRuditapes variegateandKatelysia hiantina,and 27 forSolengrandis.On average,the content of A+T(64.2%)was found significantly higher than that of G+C(35.8%). The Kimera-2-parameter model indicated that there was mean distances of 0.388 4 in pairwise-species and 0.010 6 in species.According tomaximum parsimony and neighbor joining trees for all 110 sequences of Veneroida,there was very high consistency between molecular analysis and morphological classification on family,genus, and species levels.Consequently,the findings provided essential revision and supplement to morphology taxonomy.

Veneroida;COI gene;phylogeny;taxonomy;DNA barcoding

S917.4

A

2095-1388(2013)05-0431-07

2013-02-21

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目 (CARS-48)

王琳楠 (1988-),女,碩士研究生。E-mail:xlypt@126.com

閆喜武 (1962-),男,博士,教授。E-mail:Yanxiwu2002t@163.com