姜黃素通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究＊

姜黃素（Curcumin）提純自中藥姜黃（Curcuma longa L．）的根莖，屬于酚性色素，其化學(xué)名為阿魏酰甲烷（Difcruloylmethane）。中醫(yī)認(rèn)為姜黃具有祛風(fēng)活血以及通絡(luò)止痛等功效。從20世紀(jì)80年代至今，大量研究表明，姜黃素具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［1－2］。近年研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）是有別于線粒體途徑及死亡受體途徑的可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的獨(dú)立通路。本研究采用姜黃素對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，探討姜黃素是否能夠通過(guò)ERS途徑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，為姜黃素的臨床應(yīng)用提供新的依據(jù)。

材料與方法

1 材 料 宮頸癌細(xì)胞株HeLa購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、姜黃素（C21H20O6，純度≥98%）、ERS抑制劑4－苯基丁酸鈉（4－PBA）購(gòu)自美國(guó)Sigma－Aldrich公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基以及胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Prime－Script RT Master Mix試劑盒以及SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78），C／EBP同源蛋白質(zhì)（CHOP）以及β－Actin引物均由日本Takara公司合成；GRP78及CHOP抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；β－Actin抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

2 宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng) 向DMEM培養(yǎng)基中加入10%FBS、0．1U／L鏈霉素以及0．1U／L青霉素制成細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃、飽和濕度以及5%CO2環(huán)境，隔天更換細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞密度為80%以上時(shí)按照1∶3的比例對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。

3 MTT法檢測(cè)姜黃素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用 將HeLa細(xì)胞制成濃度為1×105／ml的細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞懸液加入96孔板（GREINER，德國(guó)），共設(shè)6個(gè)平行孔，每孔加入100μl細(xì)胞懸液。6個(gè)平行孔中加入的姜黃素溶液（均由DMEM培養(yǎng)基配制）濃度分 別 為 0μmol／L（陰 性 對(duì) 照）、3．125μmol／L、6．25μmol／L、12．5μmol／L、25μmol／L 以及50μmol／L。干預(yù)48h后，向每孔中加入濃度為5mg／ml的 MTT溶液20μl繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清液后加入二甲基亞砜（DMSO）150μl，充分震蕩后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為570nm處的吸光度值（A值）。采用以下公式對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率進(jìn)行計(jì)算：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率＝（1－樣本平均A值／陰性對(duì)照平均A值）×100%。

4 試驗(yàn)分組 本研究中將細(xì)胞樣本共分為對(duì)照組（Ctrl）、對(duì)照＋4－PBA組（Ctrl＋PBA）、姜黃素組（Cur）以及姜黃素＋4－PBA組（Cur＋PBA）。姜黃素濃度為下文MTT法中篩選出的姜黃素最適濃度；根據(jù)Kubota等 的 研 究［3］，選 擇 3mmol／L 作 為 4－PBA 溶 液 （由DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基溶解）的干預(yù)濃度。

5 流式細(xì)胞儀測(cè)定宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡 將各組樣本細(xì)胞分別離心，采用含0．2%FBS的磷酸鹽緩沖液（PBS）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌后加入70%乙醇溶液中固定，將各組樣本細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為1×106／ml后先后采用Anexin V及PI（BD，美國(guó)）進(jìn)行雙染，流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，BD，美國(guó)）檢測(cè)熒光強(qiáng)度后進(jìn)行分析。

6 Real－time PCR 收集細(xì)胞樣本后，采用 Trizol法提取總Mrna，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性后，采用PrimeScript RT Master Mix試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以該cDNA為模板采用SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒進(jìn)行Real－time PCR。GRP78、CHOP及β－Actin的引物序列［4］詳見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，再以72℃延伸45s，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后再以72℃延伸10min。上述試劑盒使用均嚴(yán)格按照廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以β－Actin mRNA表達(dá)水平作為內(nèi)參，Bio－Rad IQ5（Bio－Rad，美國(guó)）軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1 Real－time PCR引物序列

7 Western Blotting 將樣本細(xì)胞離心，PBS洗滌2次，采用加入PMSF（Santa Cruz，美國(guó)）RIPA裂解緩沖液（Santa Cruz，美國(guó)）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，采用BCA法對(duì)獲得的蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定后，加入等量1×SDSPAGE loading buffer，100℃ 變 性 5min 后 進(jìn) 行 SDSPAGE垂直電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，10%脫脂牛奶封閉1h，一抗孵育過(guò)夜，充分洗滌后加入二抗（1∶5000）孵育2h，充分洗滌后，采用Super Signal West Pico化學(xué)熒光發(fā)光試劑盒（Thermo，美國(guó)）對(duì)所檢測(cè)蛋白進(jìn)行顯影，X膠片曝光后，以β－Actin作為內(nèi)參，采用Image－Pro Plus（Version 5．0．2）軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究所得數(shù)據(jù)均采用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，數(shù)據(jù)均錄入Excel并采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17．0進(jìn)行分析處理，統(tǒng)計(jì)方法為單因素方差分析，均以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法檢測(cè)姜黃素對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與姜黃素干預(yù)濃度確定 陰性對(duì)照HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，分 別 采 用 3．125μmol／L、6．25μmol／L、12．5μmol／L、25μmol／L以及50μmol／L濃度的姜黃素溶液對(duì)HeLa細(xì)胞干預(yù)48h后，細(xì)胞生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制，并呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性，與陰性對(duì)照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。本研究選取25μmol／L作為后續(xù)試驗(yàn)中姜黃素的干預(yù)濃度。見(jiàn)表2。

2 姜黃素對(duì)各組HeLa細(xì)胞凋亡的影響 在流式細(xì)胞分析圖上，正常細(xì)胞處于Q3區(qū)，早期凋亡細(xì)胞處于Q4區(qū)，晚期凋亡細(xì)胞／壞死細(xì)胞處于Q2區(qū)，細(xì)胞碎片則處于Q1區(qū)。處于（Q2＋Q4）區(qū)的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比即為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率。本研究發(fā)現(xiàn)，Ctrl組、Ctrl＋PBA組、Cur組以及Cur＋PBA組凋亡誘導(dǎo)率分別為4．15%、5．22%、68．37%以及49．28%。與Ctrl及Ctrl＋PBA組相比，Cur組HeLa細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率顯著升高（P＜0．05）；與Cur組相比，Cur＋PBA組HeLa細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0．05）。見(jiàn)圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HeLa細(xì)胞凋亡情況比較

3 姜黃素對(duì)各組HeLa細(xì)胞GRP78及CHOP mRNA表達(dá)的影響 本研究發(fā)現(xiàn)，與Ctrl組及Ctrl＋PBA組相比，Cur組GRP78及CHOP mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0．05）；與Cur組相比，Cur＋PBA組GRP78及CHOP mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0．05）。見(jiàn)圖2。

4 姜黃素對(duì)各組HeLa細(xì)胞GRP78及CHOP蛋白表達(dá)水平的影響 本研究發(fā)現(xiàn)，與Ctrl組及Ctrl＋PBA組相比，Cur組GRP78及CHOP蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0．05）；與Cur組相比，Cur＋PBA組GRP78及CHOP蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0．05）。見(jiàn)圖3。

表2 不同濃度姜黃素溶液對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的情況（48h）

圖2 姜黃素對(duì)各組HeLa細(xì)胞GRP78及CHOP mRNA水平的影響

圖3 姜黃素對(duì)各組HeLa細(xì)胞GRP78及CHOP蛋白表達(dá)水平的影響

討 論

作為發(fā)病率僅次于乳腺癌的第二大女性惡性腫瘤，宮頸癌對(duì)女性健康危害極大。目前，對(duì)于早期宮頸癌，臨床治療以手術(shù)切除為主，而對(duì)于中晚期患者，化學(xué)治療等藥物治療則成為主要治療方式。雖具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，但化學(xué)治療藥物具有細(xì)胞毒性大、不良反應(yīng)多等缺點(diǎn)，因此具有高效低毒特點(diǎn)的抗腫瘤藥物具有廣闊的應(yīng)用前景。姜黃素為中藥姜黃的主要有效成分，研究表明除具有抗炎、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、降血壓以及抗纖維化等藥理活性外［5］，近年越來(lái)越多的研究表明，姜黃素還具有顯著的抗腫瘤活性，對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC7721、乳腺癌、人類(lèi)白血病細(xì)胞 HL－60以及人舌癌細(xì)胞Tca8113等細(xì)胞系均具有顯著的抑制作用，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)顯著的凋亡［6］。

細(xì)胞凋亡又稱(chēng)為程序性細(xì)胞死亡，是有別于細(xì)胞壞死的細(xì)胞死亡方式。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是多種化療藥物的共同作用機(jī)制，可以作為藥物抗腫瘤能力的衡量標(biāo)準(zhǔn)之一。已經(jīng)有研究證實(shí)，姜黃素不但能抑制宮頸癌細(xì)胞系Siha在體內(nèi)、外的增殖，而且姜黃素能夠誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞系HeLa、SiHa、CaSki以及C33A發(fā)生明顯凋亡［7－8］。本研究通過(guò) MTT法及流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)，姜黃素不但對(duì)宮頸癌細(xì)胞系HeLa增殖具有顯著的抑制作用，而且能夠誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，這與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致。

一般認(rèn)為，內(nèi)、外因素能夠通過(guò)線粒體途徑、死亡受體途徑以及ERS途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ER是重要的細(xì)胞器，是新生蛋白質(zhì)合成與加工的重要場(chǎng)所，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定與正常功能具有關(guān)鍵作用。在不良信號(hào)的刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所發(fā)生的鈣離子平衡失調(diào)以及未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）等，稱(chēng)為ERS［9］。嚴(yán)重而持續(xù)的ERS可直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。作為定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的折疊伴侶蛋白，GRP78被認(rèn)為是ERS發(fā)生的主要分子標(biāo)志之一［10］。ERS發(fā)生可最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子CHOP的活化，作為ERS誘導(dǎo)凋亡信號(hào)通路下游的關(guān)鍵分子，表達(dá)增高的CHOP不僅可抑制抗凋亡蛋白BCL－2的表達(dá)，而且能夠促進(jìn)促凋亡蛋白BAX／BAK的表達(dá)，最終誘發(fā)Caspase分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，DNA內(nèi)切酶PARP活化，后者使細(xì)胞核內(nèi)的DNA降解，細(xì)胞發(fā)生凋亡［11］。4－PBA屬于低分子量游離脂肪酸的一種，是一種用于治療鳥(niǎo)氨酸循環(huán)障礙疾病的經(jīng)典藥物。新近研究表明，作為一種化學(xué)伴侶，4－PBA對(duì)ERS可起到抑制作用［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，使用姜黃素處理HeLa細(xì)胞后，在發(fā)生增殖抑制及細(xì)胞凋亡的同時(shí)，HeLa細(xì)胞內(nèi)GRP78及CHOP在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平表達(dá)增高，提示姜黃素可通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在使用姜黃素對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，使用ERS抑制劑4－PBA能夠顯著降低HeLa細(xì)胞的凋亡率，同時(shí)HeLa細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78與凋亡誘導(dǎo)分子CHOP的mRNA及蛋白表達(dá)水平均被顯著抑制，該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明姜黃素能夠通過(guò)激活ERS相關(guān)通路誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡。

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