一個拮抗灰葡萄孢菌的AMP核苷酶基因的生物信息學分析

賈立君，李鳳霞，馬匯泉

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院佳木斯分院 佳木斯；2.山東理工大學生命科學學院）

近年來，人們陸續(xù)通過宏基因組技術，篩選到新的生物素合成操縱子、脂（酯）酶、瓊脂糖酶、甘油脫水酶、蛋白酶和抗菌化合物及合成酶基因簇等[1-2]。劉舒等人通過構建番茄灰霉病病株根際土壤宏基因組文庫，通過功能篩選法成功篩選到5 個（4#、9#、11#、15#、17#）對灰葡萄孢菌具有拮抗性的克隆子，其中9#克隆子的拮抗性最強，并對其進行測序，這為番茄灰霉病的生物防治提供了一條新的研究思路。

生物信息學分析是目前推測基因或蛋白質(zhì)功能的一個非常有利的手段[3]，應用生物信息學對基因結構或功能進行預測，再加以實驗驗證，可以大大提高實驗的準確度和精確度。基于番茄灰霉病病株根際土壤宏基因文庫中的9#克隆子的測序結果，對其進行生物信息學分析，為進一步研究該基因對灰葡萄孢菌的拮抗機理提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 9#克隆子DNA 序列（1 033 bp）：

GGAGAACGCGGTGGCGGCCGCTCTAGACTAGT GGATCCCCCGGGCTGCAGGGTTTTGGAAAGTATATT CTCCTCTGTAATTTCAACAATTATGTGGAGCTGTTTG CAGGATGGCACAAGGTGAAGGTGATCGGAGAGGAC CGCCCCATGCAATGTGCCACGGCGGAAGGGATCAC CATTATCAATTTCGGCATGGGCAGTGCCAGCGCGGCCACCATCATGGACCTGCTCAGCGCCATCAAACCCAA GGCTGTCTTGTTTTTGGGAAAGTGCGGGGGCATCAA ACGGAAGAATAAGCTGGGGGACCTGATCCTCCCCA TTGCAGCCATCCGGGGAGAAGGCGCCTCGGACGAT TATTTCCC1GCCCGAGGTGCCGGCATTACCGGCCTTC GCGCTGCAAAAAGCCACTTCCACGGCCATTCGTGAT AACAACCGTGATTATTGGACCGGGACCTGCTACAGC ACTAACAGGCGTGTCTGGGAGCATGACGGTGAGTTC AAAAAATACCTTAATAAAATACGCGCGATGGCAGT GGACATGGAAACCGCCACGATCTTCACGGTGGGAT TTTACAACCACATCCCCACCGGCGCTCTCCTGCTGG TATCCGACCGGCCCATGATCGCCGAGGGCGTCAAG ACCGAGAATAGCGATAAAGGCATCACGGCTAACTA TGTGGAGCTTCACCTTAAGATTGGCATTGATTCACTG AAACATCTGATCAATAAAGGGTTGACGGTAAAGCA CCTCATATTCTGAATCTCCCGGAATAAGCCGAGGGT GATCAGCTTTCAACAGACCCTGCCTGATGAAGGGAC TTTAGAAACTTGCTTTAAACTGAACGTTTTACAACA AAAAAACAAGTATGCAACAGGTAGAACATATTGCG ATCGCCGTCAAATCCCTCGAACAAGGCCATTCAGCT TTATGAACGCTTGCTGAACAGAAAGTGCTATAAGAC GGAGCAGGTGAAATCCGACACGGTGAATACCGCTT GTTTTGAAGACGAGGAACACCCGTGATAAATTGAC TGT。

1.2 序列結構和功能的生物信息學分析

DNA 序列及編碼蛋白序列在NCBI 中進行blastn 和blastp 同源性比對，運用ORFfinder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）尋找序列的最大開放閱讀框，用DNAMAN 翻譯序列的最大開放閱讀框，用EMBL-EBILK 中心開發(fā)的在線工具CpGPlot（http://www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/index.html）預測該序列的CpG 島，用Neural Network Promoter Prediction 工 具（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html） 預測該序列的啟動子區(qū)域，用POLYAH（http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=polyah&group=programs& subgroup=promoter）預測該序列的轉錄終止信號，用工具CodonW（http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/codonw.html）計算編碼區(qū)密碼子的偏好性，用Expasy 提供的ProtParam、ProtScale、COIL 等工具（http://expasy.org/tools/）分別預測蛋白序列的基本理化性質(zhì)、親疏水性、卷曲螺旋區(qū) 域， 用 TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM -2.0/） 預 測 蛋 白 的 跨 膜 區(qū) 域，用PredictProtein（http://www.predictprotein.org/）預測蛋白的二級結構，用InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/）預測蛋白的結構域，用Expasy 提供的SWISS-MODEL 和SWISS-PdbViewer 工具預測和觀察蛋白的三級結構。

2 結果與分析

2.1 DNA 序列分析

2.1.1 同源性

將該序列在Genebank 進行blastn 同源性搜索，發(fā)現(xiàn)該基因序列與面包蟲編碼黑色素抑制蛋白的MIP mRNA 以及編碼Tm-肽聚糖蛋白-SA 前體的Tm-PGRP-SA mRNA 最高相似度可達100%，但是其覆蓋率很低，只有4%（表1）。因此，需要進一步分析其編碼的蛋白質(zhì)研究其結構與功能。

表1 Genebank 中的blastn 檢索結果Table 1 The search results of blastn in Genebank

2.1.2 最大開放閱讀框

該基因147～758 bp 有一個最大開放閱讀框（ORF），612 bp，翻譯結果是：MQCATAEGITIINFGMG SASAATIMDLLSAIKPKAVLFLGKCGGIKRKNKLGDL ILPIAAIRGEGASDDYFPPEVPALPAFALQKATSTAIR DNNRDYWTGTCYSTNRRVWEHDGEFKKYLNKIRA MAVDMETATIFTVGFYNHIPTGALLLVSDRPMIAEG VKTENSDKGITANYVELHLKIGIDSLKHLINKGLTVK HLIF。

2.1.3 轉錄調(diào)控序列

CpG 島預測結果顯示，在468～670 bp 處有一個203 bp 的CpG 島，序列各個位置G+C 含量觀察值/期望值（Obs/Exp）比率=0.6，（G+C）%＞50%，CpG 島通常出現(xiàn)在基因的啟動子和起始外顯子附近，因此推測在該CpG 島附近可能存在該基因的啟動子和起始外顯子。

啟動子區(qū)域預測結果顯示，在502～552 bp 和942～992 bp 區(qū)域有2 個啟動子，但是第二個啟動子位于轉錄終止信號的下游方向，所以502～552 bp 處的啟動子區(qū)域才是可能的啟動子區(qū)域。

轉錄終止信號預測結果顯示，在510 bp 和723 bp 處有2 個可能的polyA 位點，因為序列本身存在重復序列，推測510 bp 處的polyA 位點為假陽性。

2.1.4 編碼區(qū)密碼子的偏好性

編碼區(qū)密碼子的偏好性計算結果表明，該基因編碼區(qū)有效密碼子數(shù)目Nc 值50.49，說明該基因編碼區(qū)不存在特別明顯的密碼子偏好性。采用CUPS、CondonW 程序及密碼子數(shù)據(jù)庫對編碼區(qū)密碼子統(tǒng)計分 析，ACG、AGC、TTG、TTT、GGG、ATC、AAA、CGG、GAT、TAT、TTC 和CCG 這12 個密碼子為該基因使用頻繁的密碼子。通過不同物種或基因間密碼子使用頻率比對，可擇優(yōu)選擇表達系統(tǒng)或改變密碼子，從而提高外源基因的表達。但外源基因的表達受到多種因素的共同作用，密碼子使用的影響只是其中之一。

2.2 編碼蛋白的一級結構

2.2.1 編碼蛋白的基本理化性質(zhì)

該蛋白的理論分子量為22.186 7 KDa，G+C 含量51.4%，編碼203 個氨基酸，等電點為8.91，含堿性氨基酸（H，K，R）29 個，酸性氨基酸（D，E）20 個，疏水氨基酸（A，F(xiàn)，I，L，M，P，V，W，Y）98 個，極性氨基酸（S，T，N，Q，Y，C，D，E，H，K，R）94 個，正電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為22，負電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為18，分子式為C1816H2722N424O480S26，不穩(wěn)定系數(shù)為18.95（小于40），歸為穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為96.21，總平均疏水性為0.006，表明其為疏水性脂溶蛋白。

2.2.2 編碼蛋白的同源性

將蛋白序列在NCBI 中進行blastp 比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白與黃桿菌菌株DSM2366 和鞘脂桿菌株21 的AMP 核苷酶序列的同源性較高（表2），與通過Swiss-Prot 同源搜索的結果一致，推測該編碼蛋白可能是一種新型的AMP 核苷酶。

表2 NCBI 中的blastp 檢索結果Table 2 The search results of blastp at NCBI

2.2.3 編碼蛋白的親疏水性

編碼蛋白親疏水性計算結果顯示，在13、27、39、57、79、137、149 氨基酸位點附近屬高疏水性區(qū)域，在44～50、91～100、104～122、164～171 氨基酸區(qū)域屬高親水性區(qū)域（圖1）。蛋白質(zhì)折疊時會形成疏水內(nèi)核和親水表面，同時在潛在的跨膜區(qū)會出現(xiàn)高疏水值區(qū)域，因此推測在預測的7 個高疏水性區(qū)域可能存在跨膜區(qū)。

2.2.4 編碼蛋白的跨膜區(qū)

編碼蛋白跨膜區(qū)的預測結果顯示，1～8 氨基酸位于膜外，跨膜區(qū)位于9～31 氨基酸區(qū)域，32～203 氨基酸位于膜內(nèi)（圖2），結合該蛋白的親疏水性分析，跨膜區(qū)屬于疏水性區(qū)域，預測的編碼蛋白的二級結構顯示，該跨膜區(qū)富含螺旋結構。

圖1 編碼蛋白親疏水性分布圖Fig.1 Hydropathy profile of coding protein

圖2 編碼蛋白跨膜區(qū)預測Fig.2 Prediction of coding protein transmembrane region

圖3 編碼蛋白卷曲螺旋區(qū)預測Fig.3 Prediction of coding protein coiled-coil region

2.2.5 編碼蛋白的卷曲螺旋區(qū)

編碼蛋白卷曲螺旋區(qū)的預測結果顯示，在111～134 氨基酸區(qū)域內(nèi)存在一個卷曲螺旋（圖3），卷曲螺旋結構存在于許多天然蛋白質(zhì)中，如轉錄因子、膜蛋白等，它們在基因調(diào)控、分子識別方面具有重要作用，結合對編碼蛋白的親疏水性分析，該卷曲螺旋區(qū)域與該蛋白的一個高親水性區(qū)域重疊，因此推測該基因可能在拮抗灰葡萄孢菌過程中識別病原菌產(chǎn)生的毒素方面起重要作用。

2.3 編碼蛋白的二級結構和結構域

編碼蛋白的二級結構的預測結果表明，該蛋白含有38.92%的α 螺旋，17.73%的β 折疊，43.35%的環(huán)狀結構。結構域預測結果顯示，該蛋白在9～160 氨基酸區(qū)域存在AMP 磷酸化酶結構域，屬于PNPUDP-1 超家族（圖4）。模體搜索發(fā)現(xiàn)該蛋白含有5個蛋白激酶C 磷酸化位點（106～108、154～156、168～170、187～189、197～199），1 個酪蛋白激酶II 磷酸化位點（23～25），3 個N-豆蔻酰化位點（15～17、101～103、171～173），這些位點均與細胞內(nèi)信號傳導、蛋白定位以及黏附等過程有關，推測該基因可能在拮抗灰葡萄孢菌過程的信號轉導中發(fā)揮重要作用。

圖4 編碼蛋白結構域預測Fig.4 Prediction of coding protein domain

2.4 編碼蛋白的三級結構及分析

采用同源建模法預測編碼蛋白的三級結構（圖5），編碼蛋白和1ybf 蛋白的A 鏈具有較高的相似度（65%），通過Anolea/Gromos/Verify3D 3 個評估程序檢測模型的健康度顯示預測的蛋白模型能量較低，健康度較高。

圖5 編碼蛋白三級結構預測Fig.5 Predicton of coding protein tertiary structure

通過SWISS-PdbViewer 觀察編碼蛋白的三維模型（圖6），結果顯示有194 個氨基酸殘基（97.54%）的二面角落在允許的范圍內(nèi)，175 個氨基酸殘基（86.21%）的二面角落在最允許的范圍內(nèi)，只有9 個氨基酸殘基（4.43%）的二面角落在不允許的范圍，結果表明編碼蛋白的三維模型的二面角分布和立體構象均較為合理，符合立體化學φ、ψ 二面角分布的要求，其空間結構穩(wěn)定[4]。

圖6 編碼蛋白三維模型觀察Fig.6 Observation of coding protein tertiary structure

3 討論與結論

對基因序列進行分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白質(zhì)僅與AMP 核苷酶（Accession No.YP_004318143.1 at NCBI）具有80%的同源性，推測其可能是一種新型的AMP 核苷酶。該基因可能編碼含有203 個氨基酸的小分子量、疏水性脂溶的穩(wěn)定蛋白質(zhì)。編碼蛋白的序列中含有5 個蛋白激酶C（PKC）磷酸化位點，1 個酪蛋白激酶II 磷酸化位點，3 個N-豆蔻?；稽c。蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)控蛋白質(zhì)功能和定位的主要的翻譯后修飾，蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)對信號傳導途徑是非常重要的，磷酸化能阻止某些激酶和激活磷酸酶，從而改變正常的轉錄方向。

PKC 是一個磷脂依賴的遍在蛋白，大量研究表明，PKC 在與細胞增殖、分化和細胞程序性死亡關聯(lián)的信號傳導中發(fā)揮重要作用[5]。酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和N-豆蔻?；稽c也均與細胞內(nèi)信號傳導、蛋白定位以及黏附等過程有關。據(jù)此推測，該基因編碼的蛋白可能在拮抗灰葡萄孢菌過程的細胞黏附、信號傳導中發(fā)揮重要作用。它可能是細胞內(nèi)與分子識別有關的某個蛋白或其亞單位，卷曲螺旋結構有助于它對灰葡萄孢菌毒素分子進行識別。

灰葡萄孢菌產(chǎn)生的毒素在植物致病過程中是重要的致病因子，它能直接與寄主的DNA 結合，終止DNA 的合成，或者直接吸附于寄主的核糖體上，抑制蛋白質(zhì)的合成，由此推測AMP 核苷酶表面可能具有毒素可以識別并結合的特異性位點，而且這種識別與結合程度在不同的生物體內(nèi)是不同的。

灰葡萄孢菌毒素的主要成分是botrydial 和dlihvdrobotrydial，基本骨架是雙環(huán)狀的、非類異戊二烯倍半萜烯類化合物，AMP 核苷酶存在于許多種生物體內(nèi)，能夠催化水解核苷或核苷酸衍生物中N-糖苷鍵，由此推測灰葡萄孢菌毒素物質(zhì)的結構中可能含有N-糖苷鍵。

AMP 核苷酶可能通過信號傳導、分子識別、特異性結合、或者水解毒素N-糖苷鍵而在拮抗灰葡萄孢菌的過程中發(fā)揮極其重要的作用，對于該基因的生物學功能還需要進一步通過實驗進行驗證，為研究灰葡萄孢菌的拮抗機理提供理論基礎。

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