甲型流感病毒H1N1亞型HA基因的克隆及序列分析

鐘媚共，邱賢秀，向陽飛，吳崇超，王一飛

(1暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地，廣州510632;2暨南大學(xué)藥學(xué)院)

甲型流感病毒H1N1亞型是人類最常感染的流感病毒之一［1］。然而，目前對此種結(jié)合豬流感、人類流感的新病毒的流行病學(xué)了解很少。流感病毒表面血凝素(HA)是流感病毒合成的重要蛋白，病毒通過包膜上的HA吸附在宿主細(xì)胞表面，在蛋白酶的作用下，HA構(gòu)象改變，病毒包膜與內(nèi)體膜融合，脫殼，侵入細(xì)胞［4］。因此，HA蛋白是抗流感病毒藥物研發(fā)的關(guān)鍵靶點。同時，HA具有亞型特異性，可誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生［5］。HA基因非常容易發(fā)生抗原漂移，可引起致病性更強(qiáng)的新型流感病毒出現(xiàn)［6］，使待測病毒與標(biāo)準(zhǔn)檢測抗體的交叉反應(yīng)性差，疫苗的防治效果也難以達(dá)到預(yù)期，這給檢測及防治工作帶來極大的困難。我們于2011年11月～2012年8月進(jìn)行本研究，克隆甲型流感病毒H1N1亞型血凝素HA基因，并對其進(jìn)行序列分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與病毒 犬腎傳代MDCK細(xì)胞購自美國ATCC公司，由本實驗室保存;甲型流感病毒Influenza A/WSN/33(H1N1)由日本長崎大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究生院分子微生物和免疫學(xué)系傳染性病原體分子生物學(xué)實驗室饋贈，病毒在雞胚中活化增殖后，其滴度為10－4TCID50/mL，實驗用100 TCID50/mL。

1.1.2 菌種及載體 E.coli DH5α 菌株購自Promega公司，由本實驗室保存;載體pET 28a(+)質(zhì)粒購自Novagen公司。

1.1.3 試劑 細(xì)胞培養(yǎng)用的MEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司;用于病毒總RNA提取的TRIzol試劑購自Invitrogen公司;DEPC水購自廣州斯佳生物有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit、DL 2000 DNA Marker、DL 5000 DNA Marker、1 kb DNA Marker、限制性內(nèi)切酶 Hind Ⅲ和XhoⅠ及T4 DNA連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司;KOD Plus Neo購自TOYOBO公司;膠回收及質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自O(shè)MEGA公司;TRYPTONE和YEAST EXTRACT購自O(shè)XOID公司;引物合成及重組質(zhì)粒的測序均由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.1.4 儀器 電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱及生化培養(yǎng)箱購自湖北黃石市醫(yī)療器械廠;倒置相差顯微鏡購自日本Olympus;低溫高速離心機(jī)購自德國Hettich公司;核酸蛋白分析儀購自 Beckman Coulter;PCR擴(kuò)增儀購自美國MJ Research;凝膠成像分析系統(tǒng)購自英國Syngene公司;電泳儀購自北京六一儀器廠;臺式高速離心機(jī)購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中公布的A/WSN/33流感病毒血凝素基因序列(GenBank Accession No.J02176.1)設(shè)計引物。上游引物P1:5'-CCCAAGCTTATGAAGGCAAAACTACTG-3'，下 劃線部分為 HindⅢ酶切位點;下游引物 P2:5'-CCGCTCGAGTCAGATGCATATTCTG-3'，下劃線部分為XhoⅠ酶切位點。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。加三蒸水溶解引物使之終濃度為10 μmol/L，－20 ℃保存。

1.2.2 病毒RNA的提取 MDCK細(xì)胞培養(yǎng)至單層，加入病毒液，37℃、5%CO2培養(yǎng)至當(dāng)75%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變時棄去培養(yǎng)液，按10 cm2細(xì)胞/mL TRIzol的比例加入TRIzol試劑，室溫放置5 min，使細(xì)胞充分裂解，按照試劑說明提取病毒總RNA［7］。

1.2.2 HA基因的PCR擴(kuò)增與純化 利用Prime-Script RT reagent Kit的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA為模板PCR擴(kuò)增病毒HA基因，PCR反應(yīng)體系如下:32 μL ddH2O，5 μL 10 × PCR buffer for KOD Plus Neo，3 μL 25 mmol/L MgSO4，1.5 μL P1，1.5 μL P2，5 μL 2 mmmol/L dNTPs，1 μL KOD Plus Neo，1 μL cDNA。反應(yīng)條件為:94℃ 2 min、98℃ 10 s、61℃30 s、68℃ 50 s，29個循環(huán)，4℃至結(jié)束。1%PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收試劑盒回收純化目的片段。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)質(zhì)粒小量抽提試劑盒的方法抽提pET 28a(+)質(zhì)粒，抽提產(chǎn)物－20℃保存。目的基因和pET 28a(+)質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，然后按照T4 DNA連接酶的反應(yīng)體系16℃連接過夜。

1.2.4 轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒鑒定 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取100 μL轉(zhuǎn)化菌液涂布于含1‰卡那霉素的LB培養(yǎng)基瓊脂平板上，37℃倒置平板培養(yǎng)過夜。挑取單克隆接種于含1‰卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，搖菌培養(yǎng)過夜。取200 μL單克隆菌液，離心，棄去培養(yǎng)液后用三蒸水重懸，100℃煮沸10 min后進(jìn)行菌液PCR;剩余的菌液用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提重組質(zhì)粒，進(jìn)行HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定。PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，菌液PCR和雙酶切鑒定正確后送華大基因科技股份有限公司測序。測序結(jié)果用NCBI平臺上的BLAST工具進(jìn)行序列比對分析。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 利用生物信息學(xué)方法對病毒HA基因進(jìn)行分析:編碼閱讀框的預(yù)測采用ORF finder程序完成;蛋白的基本理化性質(zhì)分析用Expasy的 ProtParam程序;蛋白疏水性計算用ProtScale程序;跨膜結(jié)構(gòu)用TMHMM程序預(yù)測;信號肽預(yù)測經(jīng)SignalP4.0程序進(jìn)行;二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測用SOPMA方法進(jìn)行;亞細(xì)胞定位用PSORT程序;蛋白的功能分類用ProtFun服務(wù)工具預(yù)測。蛋白的糖基化位點預(yù)測用NetNGlyc1.0服務(wù)程序完成。

2 結(jié)果

2.1 病毒HA基因的PCR擴(kuò)增 將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以該cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1所示，在1 500～2 000 bp處獲得1條特異性擴(kuò)增的條帶，大小約為1 700 bp。

2.2 HA基因的克隆與鑒定 目的基因經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ雙酶切及電泳回收后定向插入同樣雙酶切回收的pET 28a(+)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α后挑取陽性單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，在約1 700 bp處有一特異性條帶;搖菌提取質(zhì)粒進(jìn)行HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定，得到載體條帶和目的基因條帶。見圖2。

圖1 PCR合成HA的DNA序列

圖2 重組pET 28a(+)-HA質(zhì)粒限制酶分析

2.3 HA基因的序列分析 將初步鑒定正確的重組質(zhì)粒送華大基因科技股份有限公司測序，測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pET 28a(+)-HA成功構(gòu)建，HA基因含1 698 bp的編碼區(qū)，編碼565個氨基酸。所得基因序列與GenBank上已登錄的甲型流感病毒W(wǎng)SN/33(H1N1)的HA基因序列進(jìn)行比對，序列相似性達(dá)99%。兩個序列編碼的氨基酸序列比對后發(fā)現(xiàn)，其同源性同樣為99%，氨基酸殘基有1個位點存在差異，為399位G/R。此外兩個氨基酸序列都具有相似的保守區(qū)域，因此推斷本研究獲得的基因為病毒的HA基因。

2.4 生物信息學(xué)分析 對HA基因進(jìn)行ORF finder分析，發(fā)現(xiàn)其mRNA序列中第33到第1 730個堿基之間存在1個1 698 bp的開放閱讀框。利用Expasy的ProtParam程序分析H1N1血凝素蛋白的基本性質(zhì)，結(jié)果顯示HA基因編碼565個氨基酸，其中酸性氨基酸(Asp+Glu)有59個，堿性氨基酸(Arg+Lys)有56個，蛋白分子式為C2824H4359N765O856S25，相對分子量為 63 524.7 dal，理論 pI值為6.55;不穩(wěn)定系數(shù)37.18，表明該蛋白較為穩(wěn)定;總平均親水性為－0.379，是一個親水蛋白。運用ProtScale分析HA蛋白，得到其親/疏水性圖譜，結(jié)果HA蛋白中親水性氨基酸明顯較多，在整個氨基酸序列中均勻分布，整個多肽鏈表現(xiàn)為親水性，與Protparam分析結(jié)果一致。用TMHMM程序預(yù)測HA蛋白的跨膜區(qū)，發(fā)現(xiàn)HA蛋白中可能存在一個跨膜結(jié)構(gòu)。SignalP4.0信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，HA蛋白有一個信號肽結(jié)構(gòu)。SOPMA分析結(jié)果顯示，血凝素蛋白的二級結(jié)構(gòu)包括不規(guī)則卷曲(39.29%)、α-螺旋(32.21%)、延伸鏈(22.30%)和 β-轉(zhuǎn)角(6.19%)4 種形式，卷曲結(jié)構(gòu)和螺旋結(jié)構(gòu)散布于整個蛋白質(zhì)中，構(gòu)成HA蛋白二級結(jié)構(gòu)的骨架。通過PSORT程序分析HA蛋白的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)HA蛋白最可能定位于病毒包膜上。通過CBS的Protfun工具預(yù)測分析HA蛋白的功能，結(jié)果顯示其為病毒包膜的組成成分。糖基化位點預(yù)測分析結(jié)果顯示，HA蛋白氨基酸序列共有7個 潛 在 糖 基 化 位 點，分 別 是-NNST-、-NSTD-、-NITG-、-NHTF-、-NASM-、-NGTY-和-NGSL-，位 于 第27、28、73、142、285、497 和 556 位，其中第 27 和 28位為重疊的糖基化位點。

3 討論

2009年墨西哥、美國爆發(fā)H1N1疫潮，疫情其后蔓延到全世界［2］。2009年6月WHO將全球流感大流行警告級別提升至最高等級第6級［3］。

流感病毒是一種單負(fù)鏈RNA病毒，其基因組由8個節(jié)段組成，第4節(jié)段編碼的血凝素蛋白HA是位于病毒囊膜表面的一種蛋白質(zhì)［8］。HA可識別和結(jié)合靶細(xì)胞受體，參與細(xì)胞膜的融合，并可誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生，因此，它在病毒的吸附和穿膜過程、病毒的致病力、宿主的特異性方面均起決定性作用，是目前研究最多和最深入的流感病毒基因［9～11］。

本研究結(jié)合分子生物學(xué)實驗技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，用RT-PCR法獲得甲型H1N1流感病毒血凝素HA基因序列，然后將其與pET 28a(+)質(zhì)粒連接，通過PCR擴(kuò)增、酶切和序列測定證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。應(yīng)用生物信息學(xué)對HA蛋白的理化性質(zhì)、疏水性、二級結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域、蛋白功能和同源性等進(jìn)行預(yù)測分析，顯示HA基因開放讀框為1 698 bp，編碼565個氨基酸，其中酸性氨基酸(Asp+Glu)有59個，堿性氨基酸(Arg+Lys)有56個。編碼的蛋白親水性氨基酸較多，存在一個跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，最可能定位于病毒包膜上。本研究工作有助于深入研究HA在病毒復(fù)制周期中的作用和意義，為流感病毒的快速準(zhǔn)確檢測以及制備基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

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