自噬相關(guān)基因Beclin1和PTEN在子宮腺肌病中的表達(dá)及意義

杜 超

(1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安 271012;2滕州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東滕州 277500)

子宮腺肌病(adenomyosis，AM)是指具有生長功能的子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)向子宮肌層進(jìn)行性浸潤，并在其中彌漫性生長。雖屬良性病變，卻具有類似惡性腫瘤的種植、浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為［1］。是婦科常見病之一，其典型的臨床表現(xiàn)是月經(jīng)失調(diào)、進(jìn)行性痛經(jīng)及不孕，嚴(yán)重影響女性患者的生活質(zhì)量。目前子宮腺肌病的病因和發(fā)病機制尚不明確。近年來從程序性細(xì)胞死亡著手來研究該病已成國內(nèi)外研究熱點之一。

正常細(xì)胞處于增殖和死亡的平衡狀態(tài)，一旦這種平衡狀態(tài)被打破，將會引起細(xì)胞的無限制增殖，也就是永生現(xiàn)象。是腫瘤細(xì)胞常見的生長方式。程序性細(xì)胞死亡(Programmed Cell Death，PCD)是有機體在漫長的進(jìn)化過程中發(fā)展起來的自殺機制，在清除無用的多余的或癌變的細(xì)胞，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要的作用。主要有兩種形式:一種是凋亡(Apoptosis)，另一種是自噬(Autophagy)。兩者均是受相關(guān)基因控制的死亡程序。近年來從凋亡角度研究子宮腺肌病表明了子宮腺肌病的發(fā)生受到一些凋亡基因的調(diào)控。自噬不同于凋亡，是細(xì)胞在能量缺乏的狀態(tài)下，通過降解細(xì)胞內(nèi)多余或無效的成分獲得營養(yǎng)而存活。兩者在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面共同起作用。細(xì)胞自噬相關(guān)基因Beclin1是真核生物參與細(xì)胞自噬的特異性基因，被稱為與自噬有關(guān)的抑癌基因。Beclin1蛋白是自噬與凋亡重要的匯合點。Beclin1不僅能促進(jìn)自噬，還能促進(jìn)凋亡。PTEN是一種生長控制基因，屬于抑癌基因的一種。也是繼p53后發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤中最常發(fā)生突變的抑癌基因。有報道表明，PTEN和多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，它通過多種方式(如表達(dá)缺失、基因突變等)參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后。其突變發(fā)生率在子宮內(nèi)膜癌最高［2］。

我們采用免疫組織化學(xué)方法檢測子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜與正常子宮內(nèi)膜、Beclin1、PTEN表達(dá)情況，以探討B(tài)eclin1、PTEN在子宮腺肌病發(fā)生、發(fā)展中的作用以及相互間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2011年12月至2012年12月因子宮腺肌病且排除內(nèi)膜其他病變，行手術(shù)治療的患者30例為實驗組，取其30例患者在位及異位子宮內(nèi)膜組織作為實驗標(biāo)本。其中子宮腺肌病在位子宮內(nèi)膜增生期16例，分泌期14例;異位子宮內(nèi)膜增生期17例，分泌期13例;并以同期因子宮肌瘤行手術(shù)治療(術(shù)后經(jīng)病理檢查證實為子宮肌瘤)而切除的正常內(nèi)膜32例作為對照組，其中子宮內(nèi)膜增生期6例，分泌期14例。年齡分布在38～54歲，平均年齡(45.1±4.2)歲。所有患者月經(jīng)周期大致規(guī)律。以上患者術(shù)前三個月內(nèi)均未使用激素類避孕藥具。排除合并其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌疾病、免疫性疾病、腫瘤性疾病的患者。以上組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，均制作成石蠟塊。

1.2 免疫組化檢測試劑與方法

兔抗人Beclin1單克隆抗體、兔抗人PTEN單克隆抗體(購自Cell Signaling公司)，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)試劑盒、DAB試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，每例組織石蠟切片共4張，1張用于HE染色核實病理診斷，余3張行免疫組化染色。采用Power Vision法，用PBS液替代一抗作陰性對照，用已知人類子宮內(nèi)膜癌組織標(biāo)本作陽性對照。實驗步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判斷

切片均采用盲法由2位病理科醫(yī)生獨立閱片，Beclin1、PTEN染色陽性物質(zhì)均呈棕黃色，主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞的胞漿中。先在低倍鏡觀察整張切片，選擇染色滿意處隨機觀察10個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞比例和染色深度進(jìn)行綜合評定，染色強度分為:不染色(0);淡黃色(1);黃色(2)及棕黃色(3)。陽性百分?jǐn)?shù)＜5%(0分)、陽性百分?jǐn)?shù)6% ～25%(l分)、陽性百分?jǐn)?shù)26% ～50%(2分)、陽性百分?jǐn)?shù)51% ～75%(3分)、陽性百分?jǐn)?shù)＞75%(4分)。依據(jù)總積分來判斷免疫組化表達(dá)情況，總積分二陽性細(xì)胞比例評分+染色深度評分:0分為陰性(-);1～2分為弱陽性(+);3～4分為陽性(++);5～6分為強陽性(+++)。并將總評分≤2分劃分為陰性，＞2分劃分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。Beclin1和PTEN在子宮腺肌病異位病灶、在位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜陽性表達(dá)的比較采用χ2檢驗，兩兩比較用Bonferroni法校正。同一類型不同分期表達(dá)的比較采用Fisher’s檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Beclin1蛋白在異位、在位和正常子宮內(nèi)膜的不同細(xì)胞中的表達(dá):Beclin1蛋白在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的胞漿中表達(dá)為主。在正常內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜中的陽性表達(dá)率分別為84.38%、50.00%、16.67%，呈逐漸下降趨勢。經(jīng)兩兩比較顯示:在位內(nèi)膜中Beclin1的陽性表達(dá)率低于正常內(nèi)膜，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0167);異位內(nèi)膜中Beclin1的表達(dá)低于在位內(nèi)膜，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0167);見表1。

表1 Beclin1蛋白在異位、在位和正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)

Beclin1蛋白在正常子宮內(nèi)膜增生期陽性表達(dá)率高于分泌期，且兩者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。Beclin1蛋白在在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜增生期與分泌期表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);見表2。

表2 Beclin1蛋白在實驗組及對照組增生期及分泌期表達(dá)

2.2 PTEN蛋白在異位、在位和正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá):PTEN在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞漿中表達(dá)為主。在正常內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜中的陽性表達(dá)率分別為84.38%，56.67%，26.67%，呈逐漸下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。經(jīng)兩兩比較:PTEN蛋白在正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中表達(dá)高于異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中表達(dá)(P＜0.0167)。

表3 PTEN蛋白在異位、在位和正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)

PTEN在正常子宮內(nèi)膜增生期陽性表達(dá)低于分泌期，兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。PTEN在在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜增生期陽性表達(dá)率低于分泌期，兩者間表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);見表4。

表4 PTEN蛋白在實驗組及對照組增生期及分泌期表達(dá)

2.3 Beclin1和PTEN蛋白表達(dá)的相關(guān)性:將子宮腺肌病組織中Beclin1和PTEN表達(dá)按得分等級進(jìn)行相關(guān)分析，rs=0.633，P=0.000，二者的表達(dá)呈正相關(guān)。

3 討論

子宮腺肌病是婦科最常見的良性病，多發(fā)生于30～50歲的經(jīng)產(chǎn)婦，發(fā)病率為8.8% ～31.0%［3］。近幾年發(fā)病率有上升趨勢，其典型的臨床表現(xiàn)是月經(jīng)失調(diào)、進(jìn)行性痛經(jīng)及不孕，嚴(yán)重影響女性患者的生活質(zhì)量。Beclin1位于人類染色體17q21上，大約有150kb。Beclin1通過調(diào)節(jié)自噬活性而對腫瘤發(fā)生、發(fā)展起著重要作用。王贊宏等將自噬基因Beclin1真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Beclin1經(jīng)脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染人宮頸癌HeLa細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1(+)-Beclin1能使HeLa中Beclin1mRNA及蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)，并顯著抑制HeLa細(xì)胞的生長［4］，提示自噬基因Beclinl與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可有效調(diào)控腫細(xì)胞周期，抑制宮頸癌細(xì)胞的惡性增殖，提高腫瘤細(xì)胞的自噬能力。據(jù)報道75%卵巢癌、50%乳腺癌以及40%前列腺癌中存在Beclin1基因的缺失性突變［5］。本研究發(fā)現(xiàn)Beclin1在正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)率為81.25%，顯著高于子宮腺肌病異位內(nèi)膜組(16.67%)，提示Beclin1蛋白表達(dá)缺失可能是子宮腺肌病發(fā)生的早期分子條件。從正常子宮內(nèi)膜、在位內(nèi)膜到異位內(nèi)膜，Beclin1蛋白表達(dá)逐漸下降，說明Beclin1在子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展中可能起著一定的作用。

PTEN基因是位于染色體10號q23.3區(qū)，它包含9個外顯子和8個內(nèi)含子，全長200kb。其特點是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重磷酸酶活性的抑癌基因。該基因功能的缺失，被證明與多種惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)系［6］。許多不同類型的腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中都發(fā)現(xiàn)有PTEN突變。近年來，PTEN被提高到子宮內(nèi)膜的“管家基因”的高度［7］，在許多子宮內(nèi)膜相關(guān)性疾病中PTEN的表達(dá)改變都具有特殊意義。PTEN基因是一種磷酸酶通過降低PI3K激酶的濃度，提高自體吞噬活性［8］。研究表明PTEN通過抑制TOR途徑發(fā)揮促自噬的作用，PTEN的缺失表達(dá)也可能通過自噬活性的降低發(fā)揮腫瘤抑制的功能［9］。我們的結(jié)果顯示PTEN蛋白表達(dá)從正常子宮內(nèi)膜(84.38)、在位內(nèi)膜(56.67%)到異位內(nèi)膜(26.67%)逐漸下降，PTEN蛋白在這些內(nèi)膜組織中表達(dá)的差異提示它可能在子宮腺肌病的發(fā)生過程中起了一定的作用。

迄今的研究表明Beclin1與PTEN可能共同參與調(diào)節(jié)自噬活性從而在子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。近年來子宮腺肌病的發(fā)病機制已有多方面研究，至今未能起決定性作用的因素還未確定。隨著對分子生物學(xué)和程序性細(xì)胞死亡理論的進(jìn)一步研究，子宮腺肌病與程序性細(xì)胞死亡的關(guān)系日益受到重視，尤其是對子宮內(nèi)膜細(xì)胞自發(fā)性凋亡的研究。子宮腺肌病在位子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞凋亡減弱及增殖能力增強可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的破壞，進(jìn)一步削弱子宮內(nèi)膜基底層的防御功能，致使過度增殖的子宮內(nèi)膜組織突破薄弱的子宮內(nèi)膜基底層向子宮肌層侵入并繼續(xù)生長，因此，子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡、增殖失衡可能是子宮腺肌病的發(fā)病機理之一。抑制自噬可促進(jìn)細(xì)胞的增殖、生長，自噬發(fā)揮抑制異常細(xì)胞增殖和抑癌作用［10，11］。磷酸肌醇-3-激酶(PI3K/AKT(PKB))途徑是自噬調(diào)控的通路之一。I型與 III型 PI3K參與調(diào)控了細(xì)胞自噬過程。而PTEN通過負(fù)調(diào)節(jié)I型PI3K的活性從而誘導(dǎo)自噬;Ⅲ型PI3K是自噬空泡形成和空泡傳送到溶酶體所必需的，Beclin1主要通過與Ⅲ型PI3K形成復(fù)合體來調(diào)節(jié)其他的Apg蛋白定位到自噬前體結(jié)構(gòu)中，從而調(diào)節(jié)自噬活性［12］。因此，Beclin1與PTEN這兩種腫瘤抑制因子可能分別在自噬體形成和信號調(diào)控水平對自噬進(jìn)行調(diào)控［13］。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)從正常子宮內(nèi)膜、在位內(nèi)膜到異位內(nèi)膜，Beclin1、PTEN蛋白的表達(dá)均逐漸下降，兩者具有很好的相關(guān)性，提示Beclin1、PTEN可能相互作用共同參與了子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展?？傊钊胙芯緽eclin1、PTEN與自噬活性、子宮腺肌病的關(guān)系，對闡明子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展機制并最終開發(fā)新的治療手段提供理論依據(jù)。

［1］ Cheng xin，WANG Hong yan，ZHOU Xiao.an You An in vestigation of the potential maling ant Characteristics of endometriosis［J］.Chinese Journal of Clinical Oncology，2005，2(6):861-865.

［2］ Maehama T，Dixon J E.The tumor suppressor，PTEN/MMACl，dephosphorytates the lipid second messager phosphatidylionosito 3，4，5-trisphosphate［J］.J Biol chem，1998，273(22):13375-13378.

［3］ MyersMP，Stolarov JP，Eng C，et al.PTEN the tumor suppressor from human chromosome 10q23，is a dual-specificity phosphatase［J］.ProcNatlA cad SciUSA，1997，94(17):9052-9057.

［4］ 王贊宏，段振玲，李莉.自噬基因 Beclin1抑制宮頸癌 HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的研究［J］.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2011，20(5):361-364.

［5］ Aita V M，Liang X H，Murty V V，et al.Cloning and genomic organization of Beclin1，a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21［J］.Genomic，1999，59(1):59-65.

［6］ 王索云，潘峻.PTEN基因?qū)Χ喟l(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖!凋亡和侵襲力的影響及其機制的研究:［博士學(xué)位論文］.河北:河北醫(yī)科大學(xué)，2010.

［7］ Tang JM，He QY，Guo R X，et al.Phosphorylated Akt over-expression and loss of PTEN expression in non-small cell lung cancer confers poor prognosis［J］.Lung Cancer，2006，51(2):181-191.

［8］ YangZ，Klionsky DJ.An overview of the molecular mechanism of autoPhagy［J］，CurrToP Microbial Immunol，2009，335:l-32.

［9］ Li J，Yen C，LiawD，etal.PTEN，a Putative Protein tyrosine PhosPhatase gene mutated in Human brain，breast，and prostate cancer［J］.Science，1997，275(5308):1943-1947.

［10］ Ogier-Denis E，Codogno P.Autophagy:a barrier or an adaptive response to cancer［J］.Biochim Biophys Acta，2003，1603(2):113-128.

［11］ Gozuacik D，Kimchi A.Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism［J］.Oncogene，2004，23(16):2891-2906.

［12］ Edinger A L，Thompson C B.Defective autophagy leads to cancer［J］.Cancer Cell，2003，4(6):422-424.

［13］ OGIER—DENISE，CODOGNO P.AutoPhagy:a barrier or an adaptive response to cancer.［J］，Bioehim BioPhysAeta，2003，1603(2):113-128.