苯磺酰胺從碳酸酐酶ll中脫離過程的分子動(dòng)力學(xué)模擬

孫維琦 張繼龍 鄭清川,* 孫志偉 張紅星

(1吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,長春 130021;2吉林大學(xué)理論化學(xué)研究所,理論化學(xué)計(jì)算國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長春 130023;3北華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,吉林吉林 132013;4首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與家庭醫(yī)學(xué)院,北京 100069)

1 引言

二氧化碳是人體細(xì)胞內(nèi)糖類和脂肪代謝的副產(chǎn)物,必須及時(shí)從體內(nèi)清除.碳酸酐酶是與這一過程密切相關(guān)的一類重要含鋅金屬酶,它能夠催化二氧化碳和碳酸氫根離子的相互轉(zhuǎn)化.1雖然該反應(yīng)在無酶條件下也能發(fā)生,但碳酸酐酶將這個(gè)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化效率提高了一百萬倍.2人體內(nèi)大約70%的二氧化碳都是在這類酶的作用下代謝排出體外的.3除此之外,碳酸酐酶參與多種重要的生理過程,包括酸堿平衡,4骨骼的生長和功能,5代謝,6腫瘤胞外環(huán)境的酸化,7信號(hào)傳導(dǎo)和記憶等.8-10

碳酸酐酶II(CAII)是研究最廣泛的一種碳酸酐酶異構(gòu)酶,它大量存在于紅血球中,具有廣泛的組織分布.這個(gè)異構(gòu)酶也是目前已知的所有哺乳動(dòng)物碳酸酐酶中最具有催化效率的,擁有接近擴(kuò)散速度的催化速率.11除了代謝二氧化碳外,CA II催化的碳酸氫根的生成對(duì)于維持眼內(nèi)晶狀體壓力的平衡也具有重要的生理作用.12,13同時(shí),骨骼石化癥14和絕經(jīng)期后的骨質(zhì)疏松癥也都和CAII的功能紊亂相關(guān).

芳基磺胺類藥物一直被作為重要的碳酸酐酶抑制劑,許多臨床上應(yīng)用的藥物都是通過苯磺酰胺作為母體發(fā)揮作用的(圖1).15盡管對(duì)這類藥物的研究已十分充分,但卻很少有研究關(guān)注它與碳酸酐酶的具體結(jié)合過程.在這方面,分子動(dòng)力學(xué)模擬方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì).16-19因此,本文以最基本的苯磺酰胺分子作為底物,通過多種分子動(dòng)力學(xué)方法的綜合運(yùn)用,從理論上探索苯磺酰胺分子與CA II的具體結(jié)合過程及原子水平上的相互作用,確定影響動(dòng)態(tài)結(jié)合的重要氨基酸殘基.由于CA II具有整個(gè)碳酸酐酶家族的許多共性特征,因此當(dāng)前的底物結(jié)合研究將具有普遍的意義.

圖1 碳酸酐酶II及其抑制劑苯磺酰胺的結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structures of carbonic anhydrase II and its inhibitor(phenylsulfonamide)

2 計(jì)算方法

2.1 常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬

實(shí)驗(yàn)上已經(jīng)獲得了碳酸酐酶II復(fù)合小分子磺胺抑制劑的X射線衍射晶體結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org)收錄號(hào)為2WEJ.該結(jié)構(gòu)中包含了碳酸酐酶II(含有258個(gè)氨基酸殘基),一個(gè)鋅離子,基本磺胺單元,一個(gè)甘油分子和若干結(jié)晶水.甘油分子在模擬中被刪除，其它部分都保留.為了獲得穩(wěn)定的復(fù)合物結(jié)構(gòu)并進(jìn)行充分的構(gòu)象空間取樣,首先執(zhí)行常規(guī)的分子動(dòng)力學(xué)模擬.分子結(jié)構(gòu)中丟失的氫原子利用VMD程序20補(bǔ)充,然后利用其中的Solvate插件為復(fù)合物添加一個(gè)長方體的TIP3P溶劑水盒子,保證溶質(zhì)與水盒子邊界的最小距離不低于1 nm.濃度為154 mmol·L-1的Na+和Cl-被加入體系中以模擬生理?xiàng)l件同時(shí)中和體系自身的電荷.

采用PME方法21計(jì)算長程靜電相互作用,范德華相互作用在1.2-1.4 nm范圍內(nèi)逐漸減小為0.采用周期性邊界條件以模擬連續(xù)一致的行為.首先對(duì)整個(gè)體系進(jìn)行10000步的共軛梯度(CG)能量最小化,該過程采用4184 kJ·mol-1·nm-2的諧振子勢(shì)函數(shù)限制蛋白骨架和磺胺分子的位置.然后保持限制,采用Langevin控溫法22將系統(tǒng)的溫度以5 ps·K-1的速度從100 K逐漸加熱到300 K,模擬時(shí)間步長設(shè)為1 fs.此后在1 ns的時(shí)間內(nèi)將限制勢(shì)逐漸減小到0.最后控制壓力為1.01325×105Pa,在NPT系綜下對(duì)體系進(jìn)行10 ns的平衡模擬.最終得到的穩(wěn)定構(gòu)象被用于下一步的拉伸分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算.

2.2 拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬及平均力勢(shì)的計(jì)算

拉伸分子動(dòng)力學(xué)(SMD)方法是一種特殊的分子動(dòng)力學(xué)模擬方法,能夠模擬配體-受體的脫離或結(jié)合過程,已成功應(yīng)用于許多相關(guān)研究中.20,21該方法可分為兩類:常速SMD和常力SMD.在本文中使用的是前者.常速SMD方法的基本原理是在配體的某一點(diǎn)上附著一個(gè)虛擬彈簧,彈簧另一端與一個(gè)無質(zhì)量的虛擬原子相連.在模擬過程中,使虛擬原子以設(shè)定的恒速移動(dòng),虛擬彈簧產(chǎn)生形變,其彈力即可反映配體-受體間的相互作用.在上述過程中,彈力F(t)可通過下式求得:

其中,k代表勁度系數(shù),v是虛擬原子的移動(dòng)速度,x是作用點(diǎn)相對(duì)于初始位置的位移.

對(duì)于當(dāng)前的研究體系來說,基于常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬獲得穩(wěn)定復(fù)合構(gòu)象,我們固定金屬鋅離子和三個(gè)蛋白配位殘基(His94、His96和His119),將虛擬彈簧附著在磺胺小分子的質(zhì)心上,沿著底物與鋅的配位鍵方向進(jìn)行拉伸模擬.動(dòng)力學(xué)模擬步長為1 fs,軌跡每0.5 ps保存一次,拉力值每20 fs記錄一次.使用不同的隨機(jī)種子,拉伸模擬被重復(fù)三次進(jìn)行驗(yàn)證.

為了研究苯磺酰胺脫離過程的能量變化,我們基于SMD模擬獲得的脫離路徑上的特定結(jié)構(gòu)計(jì)算了沿脫離路徑的自由能變化.反應(yīng)坐標(biāo)選為苯磺酰胺質(zhì)心與配位Zn2+之間的距離(0.4-1.8 nm).NAMD(nanoscalemoleculardynamics)中的自洽偏置力(ABF)方法23被用于計(jì)算對(duì)應(yīng)于該反應(yīng)坐標(biāo)的平均力勢(shì)(PMF).為了提高計(jì)算效率,整個(gè)反應(yīng)坐標(biāo)被分成長度為0.1 nm的若干個(gè)窗口.在每個(gè)窗口內(nèi)都運(yùn)行長達(dá)2 ns的取樣模擬.最終得到的各段能量數(shù)據(jù)再通過一個(gè)附加的模擬進(jìn)行聯(lián)合.

3 結(jié)果與討論

3.1 復(fù)合體系的穩(wěn)定性

當(dāng)前研究所用的初始模型來源于X射線衍射晶體結(jié)構(gòu),其中必然存在著局部高勢(shì)能構(gòu)象,而這些構(gòu)象若不進(jìn)行充分平衡將會(huì)影響接下來的SMD模擬.因此,碳酸酐酶II-磺胺復(fù)合體系首先經(jīng)過了10 ns的常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬.蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是通過計(jì)算均方根偏差(RMSD)來表征的.圖2所示的就是10 ns的NPT模擬過程中,碳酸酐酶II的全原子以及骨架原子的RMSD隨模擬時(shí)間變化的曲線.從圖中可以看出,在該段模擬開始后的很短時(shí)間內(nèi),二者就分別穩(wěn)定在0.16、0.08 nm附近并做小幅度波動(dòng),證明蛋白的整體結(jié)構(gòu)已經(jīng)穩(wěn)定.此外,為了證明局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,當(dāng)前研究也考察了金屬配位鍵的鍵長隨模擬時(shí)間的變化.結(jié)果表明,包括磺胺分子(通過磺?；牡优c鋅配位)在內(nèi)的四個(gè)配位鍵鍵長在NPT過程中保持很好的穩(wěn)定性且與晶體結(jié)構(gòu)中的鍵長十分接近,證明局部結(jié)構(gòu)也是穩(wěn)定的.

圖2 10 ns NPT模擬過程中碳酸酐酶II的全原子和骨架原子的均方根偏差(RMSD)Fig.2 Root mean square deviation(RMSD)profiles of all atoms and backbone atoms of CAII in the 10 ns NPT simulation

3.2 拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬及PMF的計(jì)算

基于上述獲得的穩(wěn)定復(fù)合物構(gòu)象,拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬被用于研究磺胺小分子從碳酸酐酶II中脫離的過程.對(duì)于拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬來說,拉伸方向、拉伸速度和虛擬彈簧的勁度系數(shù)都對(duì)最終的拉力曲線有直接的影響.24-26磺胺小分子與碳酸酐酶II的結(jié)合構(gòu)象顯示,底物的脫離不存在多種不同的路徑,我們的模擬測(cè)試也證實(shí)了方向的差異對(duì)拉力曲線的影響不大.關(guān)于拉伸速度和勁度系數(shù),結(jié)合已有的類似模擬,16,24-26當(dāng)前研究分別考察了三種不同的勁度系數(shù)(5000、350和1 pN·nm-1)和兩種不同拉伸速度(0.2和0.5 nm·ns-1)下得到的拉力曲線.不同的勁度系數(shù)會(huì)影響拉力曲線的表現(xiàn)并給出不同大小的峰值.當(dāng)勁度系數(shù)為5000 pN·nm-1時(shí),拉力曲線表現(xiàn)出很大的波動(dòng),導(dǎo)致拉力峰值難以分辨,并且拉力曲線的重現(xiàn)性不好;而1 pN·nm-1的勁度系數(shù)導(dǎo)致到達(dá)拉力峰值的時(shí)間變長,從而間接延長了模擬時(shí)間,因而也不適合當(dāng)前模擬.處于二者之間的勁度系數(shù)(350 pN·nm-1)既可以保證較快的拉力增速,降低模擬時(shí)長,又能夠適度地消除拉力曲線的波動(dòng),給出很好的拉力重現(xiàn)性.在這個(gè)勁度系數(shù)下,兩個(gè)拉伸速度也被分別進(jìn)行測(cè)試.當(dāng)拉伸速度較小時(shí)(0.2 nm·ns-1),拉力峰值出現(xiàn)的時(shí)間較晚,模擬時(shí)間相對(duì)較長(超過10 ns);而0.5 nm·ns-1的拉伸速度可以在合理的時(shí)間內(nèi)模擬出整個(gè)脫離過程,因而是較合適的拉伸速度.

在350 pN·nm-1的勁度系數(shù)和0.5 nm·ns-1的拉伸速度下,當(dāng)前研究對(duì)磺胺小分子底物從碳酸酐酶II中脫離的過程進(jìn)行了三次重復(fù)的SMD模擬,每次選擇不同的隨機(jī)數(shù)以確保統(tǒng)計(jì)結(jié)果的科學(xué)性,所得的拉力曲線如圖3所示.從圖中可以看出,三條曲線彼此重合得很好,大約在8.8 ns附近,三條曲線達(dá)到了各自的峰值,分別為1438、1419和1421 pN,三者相對(duì)平均值表現(xiàn)出了小于1%的波動(dòng)幅度,顯示了幾乎相同的脫離力.峰值之后,拉力曲線迅速降低,此時(shí)磺胺小分子脫離了碳酸酐酶II的活性位點(diǎn)進(jìn)入水溶液環(huán)境中,拉力曲線在0附近上下波動(dòng),表現(xiàn)出底物分子在水中的受力情況.

圖3 拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中拉力隨時(shí)間的變化圖譜Fig.3 Time dependence of the applied force in the steered molecular dynamics(SMD)simulation

脫離過程中的自由能變化能夠反映出配體與受體相互作用的動(dòng)態(tài)變化情況,給出脫離時(shí)的許多細(xì)節(jié)信息.基于SMD模擬的軌跡,我們計(jì)算得到了沿著上述反應(yīng)坐標(biāo)的PMF變化圖(見圖4).圖中顯示,從反應(yīng)路徑的初始點(diǎn),能量曲線即迅速上升,如此急劇的自由能消耗主要用于克服底物與金屬鋅的配位作用.直到反應(yīng)坐標(biāo)達(dá)到0.50 nm時(shí),能量的消耗達(dá)到了95 kJ·mol-1.此后能量曲線開始下降,在0.59 nm時(shí)達(dá)到一個(gè)局部極小值點(diǎn),隨后又逐步升高,最后基本穩(wěn)定下來.從PMF模擬軌跡上觀察,底物開始進(jìn)入溶劑是在反應(yīng)坐標(biāo)0.59 nm處,此時(shí)底物基本脫離活性位點(diǎn),但尚未完全進(jìn)入水環(huán)境中,而僅僅是一部分與水發(fā)生相互作用.在PMF曲線中,0.59 nm后的曲線基本反映了底物小分子的溶解過程.故此,這個(gè)極小值點(diǎn)是底物脫離過程中一個(gè)特殊的結(jié)合狀態(tài).對(duì)該點(diǎn)底物與蛋白相互作用的研究能夠揭示影響底物結(jié)合的重要?dú)埢墓δ?

圖4 沿著底物脫離反應(yīng)坐標(biāo)的PMF變化圖譜Fig.4 PMF profile along the reaction coordinate during the substrate's unbinding

3.3 磺胺小分子與酶的重要相互作用

磺胺小分子脫離碳酸酐酶II的整個(gè)過程已經(jīng)通過SMD模擬及PMF的計(jì)算清晰地呈現(xiàn)出來,這為研究脫離路徑上的關(guān)鍵氨基酸殘基提供了可能.通過考察軌跡,當(dāng)前研究詳細(xì)分析了整個(gè)脫離過程中底物小分子和碳酸酐酶II重要?dú)埢南嗷プ饔们闆r.首先,整個(gè)底物脫離過程中小分子與酶總相互作用能的計(jì)算結(jié)果顯示,靜電相互作用能對(duì)總相互作用能的貢獻(xiàn)占80%左右.這表明,靜電相互作用占據(jù)主導(dǎo)地位,能夠極大地影響小分子與酶的結(jié)合.這與小分子的性質(zhì)和酶的活性位點(diǎn)密切相關(guān).當(dāng)前研究中選取的底物是苯磺酰胺分子,這個(gè)分子的氨基上帶有一個(gè)負(fù)電荷(圖1),與碳酸酐酶II活性位點(diǎn)處的金屬鋅離子以及底物附近的帶電殘基之間存在著強(qiáng)烈的靜電力,從而導(dǎo)致了靜電作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于范德華相互作用.

圖5 苯磺酰胺分子和三個(gè)重要?dú)埢g的總相互作用能Fig.5 Profiles of the total interaction energy between phenylsulfonamide molecule and three important residues

聯(lián)合上述的PMF計(jì)算結(jié)果,所有影響底物與酶結(jié)合的重要氨基酸殘基也通過相互作用能的計(jì)算來進(jìn)行判斷.在底物脫離路徑上的所有氨基酸殘基中,Leu198、Thr199和Thr200是三個(gè)最重要的殘基.相互作用能的計(jì)算顯示,這三個(gè)殘基與苯磺酰胺之間的相互作用能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其它路徑上的殘基,并且都是以靜電作用為主導(dǎo)的.圖5給出的是它們與小分子相互作用能隨著SMD模擬時(shí)間的變化圖譜.從中可以看出,在三個(gè)殘基中,Leu198與底物的相互作用在SMD模擬的大部分時(shí)間內(nèi)遠(yuǎn)小于另外兩個(gè)殘基且多有不利于底物結(jié)合的情況發(fā)生.但這個(gè)殘基在底物分子即將脫離碳酸酐酶II的時(shí)刻,與其相互作用急劇降低,阻礙了底物的離去,因此是影響底物結(jié)合的一個(gè)重要?dú)埢?而對(duì)于Thr199和Thr200來說,二者在大多數(shù)情況下均和苯磺酰胺分子存在很強(qiáng)的相互作用,其中以Thr200作用更強(qiáng).雖然在底物分子脫離時(shí)刻這兩個(gè)殘基沒有出現(xiàn)如Leu198那樣的強(qiáng)烈阻礙作用,但因?yàn)樗鼈兣c底物長時(shí)間較大的相互作用,所以也是影響底物結(jié)合或脫離的關(guān)鍵氨基酸殘基.除了上述這三個(gè)殘基外,其它一些殘基與底物分子也有較強(qiáng)的作用.例如,Asn62和Ala65,這兩個(gè)殘基在底物脫離時(shí)刻與之的相互作用也分別達(dá)到了-27.2和-19.2 kJ·mol-1,并且二者也都是以靜電作用為主的.此外,活性位點(diǎn)鋅離子的配位殘基(His94,His96和His119)則由于靜電作用對(duì)底物的脫離起到促進(jìn)作用.與底物存在較強(qiáng)范德華相互作用的殘基是Val121,對(duì)于這個(gè)殘基來說,靜電作用和范德華相互作用在數(shù)值上相差不大,都在-8.4 kJ·mol-1附近,由此可見,這個(gè)殘基與底物的苯環(huán)之間存在較強(qiáng)的作用.

圖6 底物脫離過程中苯磺酰胺分子和重要?dú)埢g的原子水平相互作用情況Fig.6 Atomic level interaction between phenylsulfonamide and the important residues in the process of the substrate

能量的計(jì)算不能揭示底物分子脫離碳酸酐酶II時(shí)原子水平上的作用情況.因此,當(dāng)前研究詳細(xì)考察了PMF模擬軌跡中底物與酶的作用,其中脫離過程關(guān)鍵點(diǎn)的相互作用情況如圖6所示.在這一位置處(對(duì)應(yīng)于PMF曲線的波谷點(diǎn)),苯磺酰胺分子與酶殘基存在多條氫鍵,分別為底物氨基氫與Thr199的支鏈羥基氧之間的一個(gè)氫鍵和底物磺?；跖c殘基Thr200的支鏈羥基氫和主鏈氨基氫之間的兩個(gè)氫鍵,而這個(gè)磺酰氧雖然沒有與Thr199的主鏈氨基氫形成氫鍵,但兩個(gè)原子之間的距離并不太遠(yuǎn),因此可以斷定它們之間的相互作用也是相當(dāng)強(qiáng)的.而苯磺酰胺分子與Leu198之間的相互作用則發(fā)生在模擬的后續(xù)階段,主要是磺酰氧與這個(gè)殘基主鏈氨基氫之間的作用.

對(duì)模擬軌跡的考察也揭示了磺胺小分子底物脫離碳酸酐酶II整個(gè)過程中的酶和小分子的變化.對(duì)于碳酸酐酶II來說,底物小分子脫離之前,其活性位點(diǎn)處的鋅離子分別與His94、His96、His119和苯磺酰胺配位;底物脫離后,一個(gè)外來的水分子進(jìn)入活性位點(diǎn)中,占據(jù)了原來配體的位置與鋅離子形成配位鍵.碳酸酐酶II的其它殘基沒有發(fā)生較大的構(gòu)象變化,這源于該酶較強(qiáng)的活性位點(diǎn)剛性特征.8對(duì)于底物小分子來說,脫離初始階段它始終保持著磺?；蚧钚晕稽c(diǎn)方向,而其苯環(huán)則指向活性位點(diǎn)外的溶液環(huán)境.脫離后,由于磺?；鶊F(tuán)的親水性,底物發(fā)生翻轉(zhuǎn),苯環(huán)朝向活性位點(diǎn)方向,而磺酰胺部分朝向水溶劑,以利于磺?；c溶劑水分子的作用.

4 結(jié)論

磺胺類藥物分子與碳酸酐酶II的結(jié)合或脫離除了受到活性位點(diǎn)殘基的影響外,那些在底物結(jié)合路徑上的殘基也起到不可忽視的作用.對(duì)于磺胺類抑制劑來說,以苯磺酰胺為例的模擬揭示了這類底物與酶之間的靜電相互作用對(duì)于小分子與酶的結(jié)合起到關(guān)鍵角色.在結(jié)合路徑上的三個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基Leu198、Thr199和Thr200通過與底物的磺酰胺部分形成氫鍵,從而阻礙底物的離去.

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