湖北地區(qū)暴發(fā)病池塘中嗜水氣單胞菌的遺傳多樣性和毒力特征研究

張旭杰 楊五名 李彤彤 李愛華

(1.中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室, 武漢 430072;2.中國科學院大學, 北京 100049)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)隸屬于氣單胞菌科(Aeromonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas),廣泛分布于自然界的各種水體, 是多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物多種不同疾病的致病菌, 包括腸炎、爛尾病、腹水病、豎鱗病、疥瘡病等[1]。特別是, 自20世紀80年代末至今, 常引起我國養(yǎng)殖魚類暴發(fā)性的出血性敗血癥, 俗稱暴發(fā)病, 又稱運動型氣單胞菌敗血癥(MotileAeromonasSepticemia, MAS), 導致嚴重的經(jīng)濟損失[2—4]。

大量的研究表明嗜水氣單胞菌具有高度的表型、血清型和遺傳多樣性[5—7]。有研究者通過DNA指紋圖譜等技術(shù)手段, 對人類腹瀉和環(huán)境分離株進行了分型分析, 結(jié)果表明此菌具有高度種內(nèi)多樣性,未曾發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢克隆[8,9]。嗜水氣單胞菌作為魚類和貝類疾病的病原, 雖被廣泛分離鑒定, 但對引起魚類MAS的嗜水氣單胞菌的種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性缺乏系統(tǒng)研究, 因此對此病原菌在養(yǎng)殖區(qū)域中的流行規(guī)律仍不清楚, 增加了防御的難度, 只能依賴抗菌藥物進行防治。

嗜水氣單胞菌作為運動型氣單胞菌敗血癥(MAS)最常見的病原, 其在致病過程中, 多種毒力因子發(fā)揮了重要作用, 包括氣溶素、溶血素、腸毒素、蛋白酶、脂酶、S-層和鞭毛等[10—15]。嗜水氣單胞菌有致病性和非致病性菌株之分, 毒力基因常被用作標記基因, 用來區(qū)分嗜水氣單胞菌的有毒株和無毒株[16]。朱大玲等.檢測了 9株魚源嗜水氣單胞菌的毒力與毒力基因譜(Virulence gene profile)的相關(guān)性[17]。Li,et al.檢測了毒力基因alt,ahp和aerA在不同來源嗜水氣單胞菌中的分布以及不同基因型與毒力的相關(guān)性[18]。遺憾的是, 這些研究所用的嗜水氣單胞菌菌株地域來源分散, 分離年代相差甚遠,且不完全來自 MAS病魚, 有些可能分離自腸炎等其他類型的疾病, 所以對引起魚類 MAS的致病性嗜水氣單胞菌的毒力特性依然不清楚。

本研究在湖北省內(nèi)三個不同地區(qū), 從發(fā)生MAS池塘的病魚血液、肝臟、腎臟或腹水中以及同一池塘的池水和底泥中, 分離嗜水氣單胞菌, 然后對這些嗜水氣單胞菌克隆進行系統(tǒng)研究, 包括構(gòu)建基于gyrB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹, 分析腸道細菌基因間重復序列 (Enterobacterial repetitive intergenic consensus, ERIC)圖譜, 測定其毒力基因譜以及對斑馬魚的致病性, 來了解這些來源于 MAS病魚和池塘的菌株的遺傳多樣性, 以闡明運動型氣單胞菌敗血癥(MAS)的流行病學規(guī)律, 揭示其發(fā)病機理。此外,通過闡明這些菌株的遺傳特征, 為建立相應的快速檢測技術(shù), 制備地區(qū)特異性疫苗提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

病魚和水樣采集自位于湖北省的武漢、漢川和荊門三個地區(qū)的6個暴發(fā)病魚塘, 采樣時間為2006年8月至2009年7月(表2)。其中4個魚塘為單養(yǎng)魚塘： 塘1主養(yǎng)團頭魴, 塘2主養(yǎng)鰱, 塘5和塘6主養(yǎng)鯽; 塘3和塘4為混養(yǎng)魚塘, 養(yǎng)殖品種包括鯽、草魚、鰱、團頭魴和鳙。發(fā)病魚的主要癥狀為： 鰓蓋、尾鰭基部出血, 肝臟、腸壁和肛門充血, 腹腔內(nèi)有積水。

AB近交系斑馬魚取自中國科學院水生生物研究所, 體長為(3.7±0.4) cm, 體重為(0.76±0.1) g, 暫養(yǎng)于本實驗室。

TSA和TSB培養(yǎng)基購自美國BD公司, DL2000 marker、dNTP、pMD18-T載體和 ExTaq均購自TaKaRa公司, DL5000 marker購自上海萊楓生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

菌株分離 病魚的血液、肝臟、腎臟或腹水無菌接種于TSA平板; 塘2的水樣和塘3病魚的腸道內(nèi)容物通過滅菌管帶回實驗室, 于 4h內(nèi)處理完畢。病魚編號及樣品信息(表2)。

水樣直接用 PBS (pH 7.0)梯度稀釋, 腸道內(nèi)容物勻漿后用PBS梯度稀釋, 均涂布于氣單胞菌選擇培養(yǎng)基平板[19], 于28℃培養(yǎng)24h后,每平板隨機挑取2—3個菌落接種至 TSB 液體培養(yǎng)基中,振搖, 28℃培養(yǎng)10h后將培養(yǎng)物濃縮, 并用15%甘油+新鮮TSB保存于?80℃, 待進一步鑒定。

基因組的提取 細菌基因組的提取采用細菌基因組提取試劑盒(天根, 中國)。

常規(guī)生理生化鑒定 以嗜水氣單胞菌XS91-4-1[20]作為參照菌株。保種菌及參照菌株進行氧化酶、觸酶、O/F(葡萄糖氧化發(fā)酵)、運動性及弧菌抑制劑(O/129)敏感性試驗[21]。

分子生物學鑒定、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 用引物16SF (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和 16SR(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴 增 保 種 菌 的16S rRNA基因?；厥漳康钠? 用內(nèi)切酶AluI 和MboI 雙酶切, 取酶切產(chǎn)物跑 PAGE電泳。通過比較標準菌株酶切圖譜, 初步判定菌株種類[22]。

以 gyrB3F (5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′) gyrB14R(5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′)[23]為引物擴增初步鑒定菌株的gyrB基因。反應體系為：10×ExTaqBuffer, 5 μL; dNTP Mixture (各 2.5 mmol/L), 3 μL; 引物(10 μmol/mL)1 μL; 模板 DNA, 1 μL;Takara ExTaq(5 U/μL), 0.25 μL; 補滅菌蒸餾水至50 μL。擴增條件為： 94℃ 5min, 接著 30個循環(huán)：94℃ 30s, 59℃ 30s, 72℃ 90s, 最后72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體(Takara)上進行克隆測序。

用 ClustalX (1.81)軟件進行序列比對, 再用Mega4.1軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹, 并進行1000次Bootstraps 重復檢驗。

ERIC-PCR 根據(jù)Aguilera-Arreola等的程序和反應體系[24], 用引物 ERIC1R (5′-ATGTAAGCTC CTGGGGATTCAC-3′) 和 ERIC2 (5′-AAGTAAGTG ACTGGGGTGAGCG-3′)擴增基因組 DNA, 取 PCR產(chǎn)物電泳拍照, 并分析圖譜類型[25]。

毒力基因檢測 我們共檢測了7個毒力基因在病原菌中的分布, 包括氣溶素、溶血素、熱不穩(wěn)定性細胞興奮性腸毒素、熱穩(wěn)定性細胞興奮性腸毒素、彈性蛋白酶、脂酶和鞭毛基因。引物及參考文獻信息(表 1)[16,26,27]。

PCR反應采用前述擴增gyrB基因體系。PCR擴增程序為： 94℃預變性 5min; 94℃ 30s, 59℃(aerA) 或 62℃ (hlyA) 或 59℃ (alt) 或 55℃ (ast)或 57℃ (ahpB) 或57℃ (lip) 或 55℃ (fla) 30s, 72℃1min, 32個循環(huán); 72℃ 延伸10min。

表1 毒力基因擴增引物信息Tab.1 Details of the primers used for amplification of virulence genes

表2 從敗血癥暴發(fā)池塘分離的嗜水氣單胞菌Tab.2 A.hydrophila strains isolated from fishponds with outbreaks of septiceamia

為了驗證PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增, 每基因隨機挑取2—4個克隆測序, 并將序列上傳到Genbank數(shù)據(jù)庫。

毒力的測定 根據(jù) ERIC圖譜和毒力基因分布模式的不同, 選取分離自6個塘的15株代表菌株,在斑馬魚中進行攻毒試驗。無菌接種攻毒菌株于TSA平板, 28℃培養(yǎng)18h, 挑單菌落接種于TSB培養(yǎng)液, 28℃震蕩培養(yǎng)(150 r/min),于 4℃(1500 g, 5min)離心收集處于對數(shù)生長期的菌體, PBS洗滌一次, 重新懸浮菌體于 PBS, 用分光光度計調(diào)整菌液濃度為106—108CFU/mL[28]。對每株攻毒試驗病原菌, 40尾斑馬魚被隨機分為四組, 每組10尾, 實驗組腹腔注射 50 μL 濃度為 106、107、108CFU/mL 的菌液, 對照組注射50 μL PBS, 觀察兩個星期并記錄死亡率。半致死濃度(LD50)由軟件SPSS 13.0通過幾率單位加權(quán)回歸法(Bliss)計算。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定結(jié)果

共分離到30株嗜水氣單胞菌, 包括20株臨床株(分離自血液、肝臟、腎臟或腹水), 6株腸道株和4株池水株(表 2)。所有菌株均為氧化酶、觸酶陽性,葡萄糖氧化型, 具有運動性, 對弧菌抑制劑不敏感。

用gyrB序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 1)。所有的分離株在系統(tǒng)發(fā)育樹上都與A.hydrophilasubsp.hydrophilaATCC 7966T聚在一起, 形成一大枝。20株臨床株均為嗜水氣單胞菌, 且極有可能為嗜水亞種, 其gyrB序列相似性為100%。6個魚塘皆為單一種病原菌引起的發(fā)病。

與臨床株相比, 5株腸道株(4LNC203、4LNC209、4LNC212、4LNC215 和 4LNC305)和 1株池水株(PW01)的gyrB序列相似性較低。

2.2 ERIC指紋圖譜分析

所有的菌株均獨立擴增了兩次, 獲得了可重復的譜帶。標準菌株ATCC7965為參照菌株。圖 2為代表菌株的ERIC電泳圖譜。

分離自 6個塘的 20株臨床株, 1株腸道株(4LNC202) 和 3株池水株(PW06, PW14和 PW20)具有相同的ERIC圖譜, 均由6條帶組成。

2.1中6株與臨床株gyrB序列相似性較低的腸道和池水株, 具有與臨床株不同的ERIC圖譜。6株菌共有 5種不同的圖譜類型, 體現(xiàn)出高度的遺傳多樣性。

來自塘2的臨床株, 其ERIC帶型雖與其他塘的臨床株相同, 但是最小條帶(?600 bp)的拷貝數(shù)明顯高于其他塘臨床株, 因此與其他塘菌株應屬于不同的克隆。

2.3 毒力基因分布模式

30株嗜水氣單胞菌的基因組DNA經(jīng)PCR擴增之后, 7種毒力基因擴增片段都與預期的片段大小相吻合。為了確認所有產(chǎn)物均為特異性擴增, 對于每個基因, 我們隨機測序了 2—4株菌的擴增產(chǎn)物,序列均上傳到了 Genbank數(shù)據(jù)庫, 菌株編號及Genbank 登錄號(表 1)。經(jīng)Blast序列比對, 所有毒力基因均為特異性擴增。

30株菌的毒力基因分布模式(表 3)。共有3種不同的毒力基因型。所有的臨床株都含有所檢測的7種毒力基因, 其毒力基因型為：aerA+hlyA+alt+ast+ahpB+lip+fla+。6株腸道株分屬于 3種毒力基因型,顯示出最高的多樣性。4株池水株與臨床株毒力基因型相同。

2.4 毒力測定

攻毒試驗菌株的信息及半致死濃度(表 4)。15株攻毒菌株分別分離自鰱的肝臟、草魚的肝臟、團頭魴的血液和肝臟、鯽的血液和腹水、池水及鰱的腸道。來自 6個塘的臨床株都為強毒株, 攻毒斑馬魚絕大部分死亡發(fā)生在16h以內(nèi), 24h后幾乎不再死亡, 表現(xiàn)出急性毒性, 其半致死濃度(LD50)均小于105CFU/尾。分離自池水和腸道的菌株, 其中與臨床株具有相同 ERIC圖譜, 且毒力基因型相同的菌株,亦屬于強毒株, 其余菌株均屬于弱毒株(LD50>106cfu/尾) (表 3)。部分菌株, 其3個濃度組的攻毒斑馬魚均死亡,LD50定義為小于可計算的最低濃度(<9×103)。

池水株 PW01含有7種毒力基因, 其毒力基因型與臨床株相同, 但具有不同的ERIC圖譜, 屬于弱毒株。

3 討論

圖1 基于氣單胞菌屬的gyrB序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on gyrB sequences of bacteria from genera of Aeromonas

嗜水氣單胞菌是我國養(yǎng)殖魚類最重要的病原菌之一, 常引起池塘養(yǎng)殖魚類出血性敗血癥、腸炎, 豎鱗病, 爛尾爛鰭等多種疾病的流行, 不同的疾病有不同的癥狀表現(xiàn)。其發(fā)病機理、病原菌的流行規(guī)律及毒力特征至今仍不明確。 雖然嗜水氣單胞菌從20世紀80年代末期流行至今已有20余年, 筆者未檢索到對發(fā)病池塘中此病原菌遺傳多樣性和毒力特征的系統(tǒng)調(diào)查。

圖2 嗜水氣單胞菌代表菌株的ERIC圖譜Fig.2 ERIC profiles of representative Aeromonas hydrophila strains

2006—2010年, 我們從湖北省3個地區(qū)6個由嗜水氣單胞菌引發(fā)的暴發(fā)病發(fā)病魚塘中共分離了30株菌, 通過 ERIC-PCR和毒力基因檢測, 比較分析了魚類 MAS暴發(fā)池塘中此菌的遺傳多樣性和毒力特征。

嗜水氣單胞菌作為自然界的正常菌群, 具有高度的遺傳多樣性。ERIC是一類廣泛存在于細菌基因組上的基因外非編碼倒轉(zhuǎn)重復序列, 被大量用于分析嗜水氣單胞菌的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)[24,29], 具有良好的區(qū)分度。通過ERIC-PCR, 我們發(fā)現(xiàn)所有6個塘的臨床株都具有相同的帶型, 雖然塘 2的臨床株其最小條帶(?600 bp)的拷貝數(shù)明顯高于其他塘臨床株, 不屬于同一克隆, 但具有很近的親緣關(guān)系,屬于同一克隆系。肖丹等采用ERIC-PCR 方法對49株分別采集于中國浙江、江蘇、江西、廣東、湖北、上海等主要淡水養(yǎng)殖區(qū)的致病性嗜水氣單胞菌進行了基因分型[30], 發(fā)現(xiàn)49株菌共分為12個基因型。除菌株GD08、GD04 以外的廣東分離株的基因型均為Ⅷ型, 除菌株 JX04以外的江西分離株均屬Ⅵ型,而上海、浙江等地分離株的基因型均呈現(xiàn)多態(tài)性;而且不同基因型菌株的分布特點也有差異。例如,Ⅶ型菌株在廣東、江蘇、上海、浙江均有出現(xiàn), 而Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅹ型菌株僅在上海出現(xiàn)。不同基因型菌株的分布呈現(xiàn)了一定的區(qū)域性。其中有5株分離自湖北洪湖和丹江口的病魚, 除分離自洪湖的菌株HB01為基因型Ⅱ型外, 其余4株均為同一亞型。由于文中未涉及發(fā)病魚的種類、癥狀和這5株菌的圖譜, 因此無法與本文中的分離株進行直接比較。

表3 嗜水氣單胞菌的毒力基因分布模式Tab.3 Distribution patterns of virulence-gene in Aeromonas hydrophila

表4 代表菌株在斑馬魚中的攻毒結(jié)果Tab.4 Results of pathogenicity assays to zebrafish with representative strains

嗜水氣單胞菌有致病性菌株和非致病性菌株之分。隨著致病性嗜水氣單胞菌潛在毒力因子的不斷闡明, 越來越多的學者使用毒力基因作為標記基因,研究嗜水氣單胞菌的潛在毒力及致病性[15—17]。通過遺傳操作, 該菌的氣溶素(aerA)、溶血素(hlyA)、熱不穩(wěn)定性細胞興奮性腸毒素(alt)、熱穩(wěn)定性細胞興奮性腸毒素(ast)、彈性蛋白酶(ahpB)、脂酶(lip)和鞭毛基因(fla)已經(jīng)被證明在侵染過程中發(fā)揮重要作用[10—12,14,26]。本實驗檢測了這7個毒力基因在MAS暴發(fā)池塘中的流行情況, 發(fā)現(xiàn)這些基因在臨床株中的流行率皆為100%, 為多毒力基因的聯(lián)合流行。如此顯著的結(jié)果讓我們加深了對嗜水氣單胞菌暴發(fā)株的認識, 并且為池塘 MAS致病機理的解析提供了理論依據(jù)。83.3%的腸道株雖然有部分毒力基因缺失,對斑馬魚只有弱毒性, 但仍然具有多種毒力基因,這是否說明在暴發(fā)病發(fā)病池塘中, 存在致病性菌株與非致病性菌株之間的毒力基因交流？這個問題值得進一步研究。

斑馬魚作為模式動物, 已經(jīng)被證明是良好的嗜水氣單胞菌感染對象[18]。我們隨機選取了分離自不同時間、不同池塘、不同發(fā)病魚類、不同組織和不同來源的嗜水氣單胞菌, 用斑馬魚進行攻毒試驗,測定了其毒力水平。依據(jù)Li,et al.的毒力劃分標準[18],所有的臨床株皆為強毒株, 其LD50<105CFU/尾。在池水和腸道株中, 與臨床株 ERIC圖譜和毒力基因型相同的菌株, 亦屬于強毒株。其他腸道和池水株皆屬于弱毒株, 其LD50>106CFU/尾。

值得一提的是, 池水株 PW01雖與臨床株毒力基因分布模式相同, 但其gyrB序列與臨床株相似度較低, 且具有不同的ERIC圖譜類型, 屬于弱毒株。一方面這可能是由于它缺失我們未檢測的毒力基因或者未闡明的毒力基因, 另一方面也表明嗜水氣單胞菌的致病性是多因子共同作用的結(jié)果, 單純檢測毒力基因, 無法將所有的有毒株和無毒株區(qū)分開,而 ERIC-PCR結(jié)合毒力基因檢測的方法, 在此病原菌流行病學的研究中具有更可靠的應用前景。

從表 3和表4我們可以發(fā)現(xiàn), 嗜水氣單胞菌的毒力大體與菌株含有的毒力基因數(shù)量呈正相關(guān)。代表菌株的毒力測定顯示, 除池水株P(guān)W01外, 含有7個毒力基因的臨床株、腸道株和池水株均為強毒株(LD50<105CFU/尾), 缺失氣溶素的菌株(4LNC203,4LNC305)為弱毒株(LD50≥1.61×106), 同時缺失氣溶素與溶血素的菌株(4LNC209)毒力最弱(LD50=6.61×106)。這表明毒力基因作為標記基因, 在此病原菌的檢測中具有良好的應用前景。從表 3我們還發(fā)現(xiàn),aerA、hlyA和alt三個基因或許可以作為基因標記,用來區(qū)分嗜水氣單胞菌的強毒株和弱毒株。

綜上所述, 本文第一次系統(tǒng)性的研究了 MAS暴發(fā)魚塘中嗜水氣單胞菌的遺傳多樣性和毒力特征。20株臨床株分別分離自3個城市、6個不同的池塘、3個不同的年份、4個不同的時間點和5種不同的魚類, 其gyrB序列、ERIC帶型、毒力基因型和致病性, 均表明此疫區(qū)中的病原嗜水氣單胞菌屬于同一克隆系。同一池塘中的其他非同源的池水和腸道株致病性弱, 表現(xiàn)出了遺傳多樣性。在一定區(qū)域內(nèi) MAS暴發(fā)病的病原具有相似遺傳特征這一研究發(fā)現(xiàn), 提示可望借助地區(qū)特異性疫苗防御此疾病。此外, 7種重要毒力基因的廣泛流行, 為致病機理的解析提供了線索。

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