新疆葡萄樹(shù)傷流液抗氧化活性及多酚含量測(cè)定

朱富榮，伊力哈木·托合提，艾爾肯·依不拉音，*，黃瓊，布熱米古麗·買(mǎi)買(mǎi)提

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆和田師范專(zhuān)科學(xué)校生化系，新疆 和田 848000）

傷流液（bleeding sap）是指從受傷或折斷的植物組織傷口處溢出液體的現(xiàn)象，是由根壓引起的[1]，經(jīng)剪去葡萄樹(shù)的部分枝條末梢，直接接葡萄樹(shù)傷流液，收集簡(jiǎn)便，而民間將其做為廢料棄去，如果將葡萄樹(shù)傷流液進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究，不僅可防止自然資源的浪費(fèi)，還有利于開(kāi)發(fā)新的具有生物活性的產(chǎn)品。葡萄樹(shù)傷流液中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，尤其以鈣、鉀和谷氨酸含量較高[2]。禹婷等[3]報(bào)道以核桃，獼猴桃和葡萄為試材，分析和比較了3 種果樹(shù)傷流液中游離氨基酸，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的含量。伊力哈木·托合提等報(bào)道了和田葡萄樹(shù)傷流液具有抗衰老作用[4]，同時(shí)阿吉姑·阿布都熱西提等報(bào)道了葡萄樹(shù)傷流液的抗氧化活性及熱穩(wěn)定性[5]。而葡萄樹(shù)傷流液中多酚類(lèi)物質(zhì)的研究開(kāi)發(fā)卻很少，目前新疆葡萄樹(shù)傷流液已檢測(cè)到具有抗氧化、清除羥自由基及熱穩(wěn)定性等活性，原因可能與葡萄樹(shù)傷流液中的多酚類(lèi)物質(zhì)有關(guān)。

亞硝胺是目前所知的最強(qiáng)的化學(xué)致癌物質(zhì)之一，它能引起人和動(dòng)物肝臟等多種器官的惡性慢性腫瘤。正常情況下，人們直接從食物中攝入的亞硝胺極少，但形成亞硝胺的前體物質(zhì)卻大量存在于食物以及產(chǎn)生于食物在體內(nèi)的代謝過(guò)程中，特別是亞硝酸鹽在人和動(dòng)物的胃中更適于合成亞硝胺。因此，清除體內(nèi)業(yè)硝酸鹽是防止癌癥的有效途徑[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄樹(shù)傷流液：2012 年4 月初采自于和田市、和田縣、吐魯番鄯善縣、喀什市、阿圖什市，采集后立即冷凍保存，根據(jù)需要解凍。

1.2 試劑與儀器

UV-2550 紫外分光光度計(jì)：日本島津；移液器（Genex Beta，100-1000 μL）：上海瑞聰生物科技有限公司；梅特勒電子天平-AG135：梅特勒-托利多儀器有限公司；GSF-250-3 超聲清洗器：濟(jì)寧科源超聲波設(shè)備有限公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：110831-200803）：購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、抗壞血酸、乙醇、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、無(wú)水碳酸鈉、磷酸、鹽酸、溴水等均為分析純；水為二次重蒸水。

1.3 方法

1.3.1 體外清除·OH 的能力

操作按照南京建成生物工程研究所提供的·OH測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在反應(yīng)體系中加入不同產(chǎn)地的新疆葡萄樹(shù)傷流液原液0.2 mL，檢測(cè)體系中·OH 的剩余量，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。最終結(jié)果以抑制率表示。

抑制率（%）=（對(duì)照管-測(cè)定管）/對(duì)照管×100%

取三支10 mL 比色管a、b、c，準(zhǔn)確吸取一定量5 μg/mL 的NaNO2溶液兩份，分別加入到a 和c 管中，吸取6 mL 葡萄樹(shù)傷流液原液，分別加入到a 和b 管中，反應(yīng)10 min 后，a、b、c 管中分別加入0.4%的對(duì)氨基苯磺酸溶液2.0 mL，搖勻反應(yīng)5 min，再都加入0.2%的鹽酸萘已二胺1.0 mL，搖勻15 min 后，在最大吸收波長(zhǎng)538 nm 處，以b 管為參比測(cè)得a 管的吸光度為A，以試劑空白為參比測(cè)得c 管的吸光度為A。按下式計(jì)算葡萄樹(shù)傷流液對(duì)亞硝酸鈉的清除率：清除率=[（Ao-A）/Ao]×100%，式中Ao為未加提取液亞硝酸鈉的吸光度，A 為加提取液后亞硝酸鈉的吸光度。

1.3.3 Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定葡萄樹(shù)傷流液中總多酚含量

1.3.3.1 最佳測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取0.05 mg/mL 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及濃縮的樣品液各0.5 mL 于10 mL 的棕色容量瓶中，各加入0.5 mL Folin-Ciocaltou 試劑（按藥典的方法配制），加入3 mL水搖勻后，放置4 min，再加入1.5 mL 10% Na2CO3溶液，蒸餾水定容至刻度，避光靜置120 min，用分光光度計(jì)在400 nm～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)分別掃描沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與處理樣品液的吸收光譜，確定其最大吸收波長(zhǎng)為760 nm。

1.3.3.2 各試劑用量的選擇

取0.05 mg/mL 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4 mL，分別加入0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL Folin-Ciocalteu 試劑，混勻后分別加入3 mL 蒸餾水，4 min 后各加入1.5 mL 10%Na2CO3溶液，并定容至10 mL，顯色后測(cè)定其吸光度值，以確定Folin-Ciocalteu 顯色劑的用量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著Folin-Ciocalteu 試劑的增加，吸光度不斷升高，當(dāng)吸取量達(dá)到0.5 mL 時(shí)吸光度趨于穩(wěn)定，因此選擇加入0.5 mL 的Folin-Ciocalteu 試劑。

取0.05 mg/mL 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4 mL，分別加入0.5 mL Folin-Ciocalteu 試劑，混勻后分別加入3 mL蒸餾水，4 min 后分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 10%Na2CO3溶液，并定容至10 mL，顯色后測(cè)定其吸光度值，以確定10%Na2CO3溶液的用量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著Na2CO3溶液的增加，吸光度是先升高后略有下降，當(dāng)加入1.5 mL Na2CO3溶液時(shí)吸光度最大，因此選擇加入1.5 mL 的10%Na2CO3溶液。

1.3.3.3 顯色時(shí)間的選擇

精密移取0.05 mg/mL 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4 mL于10 mL 的容量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液0.5 mL，再分別加水3 mL，10%碳酸鈉溶液1.5 mL，蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置4 分鐘以相應(yīng)的試劑為空白，分別反應(yīng)10、30、60、90、120、150、180 min 在760 nm 處測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，120 min 以后吸光度趨于穩(wěn)定，考慮到效率問(wèn)題，因此顯色時(shí)間選擇120 min。

1.3.3.4 測(cè)定方法

精密量取葡萄樹(shù)傷流液濃縮液（20 倍）0.4 mL，置于10 mL 棕色容量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液0.5 mL，再加蒸餾水3 mL，搖勻，放置4 min 再加10%碳酸鈉溶液1.5 mL，蒸餾水定容至刻度，放置120 min 后，以相應(yīng)的試劑為空白，依照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在760 nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

精密量取0.05 mg/mL 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置10 mL 棕色量瓶中，以下同上。

1.3.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定新疆葡萄樹(shù)傷流液進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，反應(yīng)完全后，避光下放置0、0.5、1、2 和3 h 后測(cè)定的吸光值分別為0.770、0.772、0.778、0.779、0.779。結(jié)果表明，該方法在體系反應(yīng)完全后放置3 h 內(nèi)測(cè)定值仍比較穩(wěn)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.556%。

1.3.3.7 精密度試驗(yàn)

對(duì)Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定新疆葡萄樹(shù)傷流液多酚進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，同一樣品測(cè)定6 次，其吸光值分別為0.353、0.354、0.354、0.354、0.353、0.354，其吸光度值的RSD 為0.147%，表明該方法具有較高的精密度，所測(cè)結(jié)果可靠。

1.3.3.8 重現(xiàn)性試驗(yàn)

對(duì)Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定葡萄樹(shù)傷流液多酚進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)同一批樣品6 份，測(cè)定的吸光度值分別為0.339、0.331、0.336、0.352、0.342、0.344.其吸光度值的RSD 為2.11%，表明該法具有良好地重現(xiàn)性。

1.3.3.9 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取樣品濃縮液0.2 mL，置于9 個(gè)10 mL 的容量瓶中，再分別分加入220、280、340 μg 對(duì)照品溶液（0.05 mg/mL），按“1.3.4.4”標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)項(xiàng)下的方法，顯色后避光放置120 min，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果回收率的范圍為96.43%～104.73%。

2 結(jié)果與分析

2.1 9 種葡萄樹(shù)傷流液清除·OH 能力

按“1.3.1”項(xiàng)下的方法，測(cè)定9 種新疆葡萄樹(shù)傷流液清除羥自由基的能力，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知，除吐魯番的無(wú)核白、卡西克、白加克外，其余6 個(gè)品種的新疆葡萄樹(shù)傷流液的抑制率均大于90%，抑制率越大，間接反映了抗氧化活性越強(qiáng)。

2.2 9 種新疆葡萄樹(shù)傷流液清除的能力

表1 葡萄樹(shù)傷流液清除·OH 和的能力測(cè)定Table 1 Hydroxyl radicals and nitrite scavenging ratios of Bleeding sap of Grape tree

2.3 樣品總多酚的含量測(cè)定結(jié)果

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

按照“1.3.3.5”項(xiàng)的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1 所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve

由圖1 可知，回歸方程為y=0.122 8x+0.029 5，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 7，結(jié)果表明：沒(méi)食子酸的濃度在0～6 mg/L 范圍內(nèi)與吸光度有良好的線(xiàn)性關(guān)系。通過(guò)回歸方程及樣品濃縮液測(cè)定的吸光度，可計(jì)算出樣品濃縮液的濃度，進(jìn)一步可以得到各個(gè)品種的葡萄樹(shù)傷流液的多酚含量。

2.3.2 9 種葡萄樹(shù)傷流液的總多酚含量測(cè)定結(jié)果

精密吸取各樣品的濃縮液（20 倍）0.4 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制項(xiàng)下的方法，顯色后避光放置120 min，測(cè)定樣品的吸光度值，結(jié)果見(jiàn)下表2。

從表2 檢測(cè)結(jié)果得知，不同品種葡萄樹(shù)傷流液中的總多酚含量是不同的，即使是同一個(gè)產(chǎn)地的不同品種的葡萄樹(shù)傷流液中的總多酚含量也是不同的，總多酚含量在不同品種新疆葡萄樹(shù)傷流液中有較大差異，其范圍為2.64 mg/L～6.76 mg/L，其中吐魯番地區(qū)不同品種的葡萄樹(shù)傷流液總多酚含量相對(duì)較高，和田地區(qū)不同品種的葡萄樹(shù)傷流液總多酚含量差異較大。

表2 新疆葡萄樹(shù)傷流液總多酚含量Table 2 The Polyphenol content of Bleeding sap of Xinjiang Grape tree

3 結(jié)論

3）系統(tǒng)研究了以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，F(xiàn)olin-Ciocalteu 比色法測(cè)定新疆葡萄樹(shù)傷流液中總多酚的含量。此方法具有操作簡(jiǎn)便、精密度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，可用于新疆葡萄樹(shù)傷流液中總多酚含量的測(cè)定。品種間含量的差異，是由于Folin-Ciocalteu 法測(cè)出的是多酚類(lèi)化合物的相對(duì)總量，受多酚物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)影響很大，不同種植環(huán)境、不同種植品種的新疆葡萄樹(shù)傷流液的總多酚的含量是有差異的。

4）新疆9 種葡萄樹(shù)傷流液清除·OH 的能力大小和多酚含量的多少并不成明顯的比例關(guān)系，可能葡萄樹(shù)傷流液中的多酚并不是唯一的抗氧化活性物質(zhì)。

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