微生物單寧酶研究現(xiàn)狀

朱繼新，楊民和

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350108)

單寧酶，即單寧?；饷?EC3.1.1.20)，是一種具有水解催化能力的生物催化劑，可催化水解水合單寧如單寧酸中的酯鍵、縮酚鍵和糖苷鍵，水解產(chǎn)物為葡萄糖和五倍子酸，如圖1所示［1］。單寧酶的主要作用底物是單寧類物質(zhì)，主要由蛋白類、淀粉類、纖維素類等大分子物質(zhì)復(fù)合組成，單寧被認(rèn)為是自然界第二大多酚類物質(zhì)。傳統(tǒng)的單寧被分為濃縮單寧和水解單寧，目前公認(rèn)的是分為沒食子酸單寧、逆沒食子酸單寧、濃縮單寧和復(fù)合單寧等4大類。單寧的生物降解主要通過微生物降解和酶降解，最有效的方法是利用生物轉(zhuǎn)化把大分子單寧降解成為小分子化合物，但各種微生物對單寧的降解方式不徑相同［2-5］。

圖1 單寧酶水解1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖Fig.1 Hydrolysis of 1，2，3，4，6-pentagalloylglucose catalyzed by tannase

單寧酶是一種誘導(dǎo)酶，能由某些微生物在單寧酸等誘導(dǎo)物存在時誘導(dǎo)合成，它的水解能力和合成能力均需要在適合的環(huán)境中進行。單寧酶有著廣泛的工業(yè)應(yīng)用，例如飲料、食品、化妝品、醫(yī)藥、制革、飼料等方面。美國和日本等國家還申請了一些相關(guān)專利，美國食品與藥品監(jiān)督管理局(FDA)已經(jīng)明確了單寧酶是安全可靠的產(chǎn)品［6］，隨著單寧酶的應(yīng)用越來越廣泛深入，也為單寧酶的開發(fā)和生產(chǎn)提供了強大的動力，在商業(yè)中越來越重要。然而，單寧酶的大規(guī)模生產(chǎn)存在2個限制因素，包括較高的生產(chǎn)成本和相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)研究的缺失［5］。近年來，微生物單寧酶越來越受到研究者的青睞，其商業(yè)化應(yīng)用也越來越廣泛。

1 單寧酶的來源

單寧酶存在于動物、植物及微生物中，目前主要依靠微生物在單寧酸等誘導(dǎo)物存在情況下發(fā)酵產(chǎn)生，國內(nèi)外已報道的微生物有細菌、酵母和真菌等。這些微生物主要從各種植物的葉片、表皮、根等部位分離純化獲得，或者是來源于富含單寧的土壤或工業(yè)廢水中。目前產(chǎn)單寧酶的微生物主要是真菌類的曲霉屬和青霉屬。表1總結(jié)了近幾十年來國內(nèi)外學(xué)者對產(chǎn)單寧酶菌株來源的相關(guān)研究［5］。

表1 產(chǎn)單寧酶菌株及其來源Table1 The origin and production of the producing strains of tannase

續(xù)表

由表1可知，產(chǎn)單寧酶的微生物以絲狀真菌和細菌較多，酵母菌較少，這些工作為今后產(chǎn)單寧酶菌株的選擇提供了參考。

2 單寧酶的生產(chǎn)

單寧酶的生產(chǎn)由菌株、誘導(dǎo)底物、發(fā)酵方式和發(fā)酵條件等4個條件決定。最早報道單寧酶僅僅是在單寧酸誘導(dǎo)下產(chǎn)生的，其終產(chǎn)物為沒食子酸和葡萄糖。其后發(fā)現(xiàn)五倍子粉、沒食子酸丙酯、沒食子酸等也可作為單寧酶的誘導(dǎo)物。單寧酶的生產(chǎn)可采用固體發(fā)酵和液體發(fā)酵2種發(fā)酵方式，這2種方式可產(chǎn)生不同類型的單寧酶，分別是胞外酶和胞內(nèi)酶。多年以來，工業(yè)生產(chǎn)單寧酶都是以液體發(fā)酵為主。近些年，利用固體發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶也有許多的報道。利用微生物固體發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶有以下幾個特點:①是天然的胞外酶;②酶的產(chǎn)率較高;③酶活較高;④單寧酶的pH和溫度穩(wěn)定性較好。

早在1994年Lekha和Lonsane就對固體發(fā)酵、液體深層發(fā)酵、液體表層發(fā)酵產(chǎn)單寧酶做了比較，發(fā)現(xiàn)固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶酶活分別是其他2種液體發(fā)酵形式的2.5倍和4.8倍［7］。Cruz-Herandez等［8］利用黑曲霉GH1菌株，分別采用固體發(fā)酵和液體深層發(fā)酵方式，比較在不同溫度下產(chǎn)單寧酶的情況。結(jié)果表明，固體發(fā)酵比液體深層發(fā)酵產(chǎn)單寧酶酶活力高4倍多，達到2 291U/L。Renovato等［9］對黑曲霉分別進行固體發(fā)酵和液體發(fā)酵，其產(chǎn)生的單寧酶在結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、催化性能和等電點等方面有顯著的差異，固體發(fā)酵比液體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶的酶活高5.5倍;固體發(fā)酵和液體發(fā)酵產(chǎn)生的單寧酶在最適溫度、最適pH、分子量大小和酶的糖基化水平等方面均有不同。這是第1次報道固體發(fā)酵和液體發(fā)酵產(chǎn)生單寧酶結(jié)構(gòu)不同，為2種發(fā)酵方式產(chǎn)生的單寧酶有不同的穩(wěn)定性和催化活性提供了依據(jù)。由上所述，固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶酶活力普遍比液體發(fā)酵要高，回收更加容易。由于發(fā)酵方式的不同，所產(chǎn)生單寧酶的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)也有所差異。近些年來，以固體發(fā)酵方式生產(chǎn)單寧酶的研究逐年增多。

國內(nèi)外有很多關(guān)于產(chǎn)單寧酶培養(yǎng)條件優(yōu)化的報道。Bradoo等［10］發(fā)現(xiàn)用日本曲霉變種通過添加單一或復(fù)合糖類，當(dāng)以單寧酸為唯一碳源進行液體搖瓶發(fā)酵時，單寧酶的產(chǎn)量提高2倍多。劉如石等［11］對黑曲霉No.3菌株產(chǎn)單寧酶液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究，使單寧酶比活力達到17.71 U/mg;同時還探索了菌絲生長與產(chǎn)酶的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)黑曲霉No.3菌株產(chǎn)酶屬于生長偶聯(lián)型。Battestin等［12］利用響應(yīng)面法對擬青霉產(chǎn)單寧酶固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，在培養(yǎng)溫度為29～34℃、單寧酸添加量為8.5%～14%、稻殼∶麩皮比為50∶50的條件下，該最優(yōu)培養(yǎng)條件發(fā)酵培養(yǎng)5 d后，單寧酶酶活提高了8.6倍。保玉心等［13］經(jīng)紫外誘變篩選黑曲霉，以五倍子為誘導(dǎo)物進行固體發(fā)酵，使單寧酶酶活有很大的提高。在對培養(yǎng)基進行優(yōu)化后，單寧酶酶活達到58.2 U/g。Costa等［14］分別以單寧酸、沒食子酸和沒食子酸甲酯為誘導(dǎo)物，進行黑曲霉液體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶研究，結(jié)果表明以單寧酸為誘導(dǎo)物所產(chǎn)單寧酶酶活最高，達到 20.6 U/mL。Mnjit等［15］自制革廠排出的污水中分離篩選出產(chǎn)單寧酶菌株煙曲霉MA，首次以玫瑰果葉為固體基質(zhì)，在25℃，pH 5.0，培養(yǎng)96 h酶活最高達174.32 U/g。培養(yǎng)基中添加單寧酸或沒食子酸單寧等誘導(dǎo)物就可誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生單寧酶。谷文等［16］從鐵冬青植物組織中篩選分離得到高產(chǎn)單寧酶木霉屬真菌，采用正交設(shè)計對培養(yǎng)基進行優(yōu)化，發(fā)酵48 h后酶活力達到0.392 μmol/(min·mL)。

從上述研究看，影響單寧酶生產(chǎn)的主要培養(yǎng)條件是誘導(dǎo)物和固體基質(zhì)的選擇。目前這些菌株產(chǎn)單寧酶酶活力還不是很高，尚難于進行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。各種微生物產(chǎn)單寧酶發(fā)酵條件的優(yōu)化，將是今后進一步努力的方向。

3 單寧酶提取和純化

酶的純化是指將酶從細胞或含酶原料中分離出來，從而獲得所要求的酶制品的過程，目的是為了提高其催化能力，增強其穩(wěn)定性，防止不必要的反應(yīng)。單寧酶是一種細胞結(jié)合酶，由于液體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶主要是胞內(nèi)酶，在單寧酶的分離純化過程中微生物細胞的破壁相對比較困難，一般的破壁方法有超聲波、石英研磨和滲透法等。這些方法所得單寧酶酶活損失較大，給后續(xù)純化過程帶來困難。常規(guī)酶的純化步驟復(fù)雜、費時，而且酶活損失很大。純化倍數(shù)、回收率和洗脫時間是純化過程中典型的幾個決定性因素。

王征等［17］采用40%～80%飽和度的硫酸銨分級沉淀，再經(jīng)過透析濃縮，DEAE-纖維素陰離子交換層析，葡聚糖G-150凝膠層析，單寧酶的純化倍數(shù)達到115。劉如石等［18］經(jīng)過超濾濃縮、DEAE離子交換層析、Gephadex G-150凝膠層析和Sepharos-6B凝膠柱層析等四步純化后，酶的回收率達到11%，純化倍數(shù)達113.5。Ramirez-Coronel等［19］利用固體發(fā)酵生產(chǎn)胞外單寧酶，通過制備等電聚焦，F(xiàn)PLC陰離子交換層析和葡聚糖凝膠層析等步驟進行單寧酶純化，SDS-PAGE后得到2種單體的單寧酶，分子量分別為90 ku和180 ku。Sharma等［20］利用兩步快速純化方法，超濾濃縮除鹽，Sephadex-200凝膠層析后，純化倍數(shù)135，回收率91%。Gaikai等［21］把離子表面活性劑用于反膠團對單寧酶的濃縮和純化，因為單寧酶是高度吸水的糖蛋白，目前這種方法是Aspergillus allahabadi產(chǎn)單寧酶提取和純化的最佳方法，純化倍數(shù)12.7，回收率81.2%，單寧酶濃縮3倍;和常規(guī)的純化方法相比，在回收率較低的情況下，卻有很高的純化倍數(shù)。在濃縮過程中表面活性劑、濃縮時間、pH、離子強度和有機溶劑比例都是主要的影響因素。由于產(chǎn)單寧酶菌株及培養(yǎng)方式的不同，導(dǎo)致所使用的純化方法可能不盡相同，但總的目的是為了去除雜蛋白，提高酶的比活力，得到人們所需要的目的酶。

4 單寧酶酶學(xué)性質(zhì)的相關(guān)研究

酶學(xué)性質(zhì)和很多因素有關(guān)，如溫度、pH值、有機溶劑和金屬離子等。單寧酶的來源和培養(yǎng)條件是酶學(xué)性質(zhì)不同的主要原因，例如來自酵母和真菌的單寧酶都是糖蛋白類，但是細菌單寧酶并沒有翻譯后修飾［9］。此外，已有的研究發(fā)現(xiàn)同種微生物利用不同的培養(yǎng)方式產(chǎn)生的單寧酶在糖基化上有顯著性的差異。國內(nèi)外學(xué)者對單寧酶酶學(xué)性質(zhì)的研究見表2，酶學(xué)性質(zhì)的研究為單寧酶的產(chǎn)業(yè)化打下了堅實的基礎(chǔ)。

表2 單寧酶酶學(xué)性質(zhì)Table2 Characterization of tannase

不同來源的單寧酶酶學(xué)性質(zhì)有一定的差異，綜合分析表2可知大多數(shù)菌株產(chǎn)單寧酶最適溫度為30～50℃，Ramirez-Coronel等所研究的黑曲霉產(chǎn)單寧酶的最適反應(yīng)溫度是60～70℃，比其他研究者最適溫度要高很多，初步說明此菌所產(chǎn)單寧酶耐熱性很好。最適pH值為5.0～6.0，熱穩(wěn)定性范圍在70～80℃以下，pH穩(wěn)定范圍在3.0～8.0。但是不同來源的單寧酶的分子量的大小差別很大，最小的為45 ku，最大達到180 ku，大多數(shù)在100 ku左右。

近些年研究金屬離子、表面活性劑以及有機溶劑對單寧酶影響的相關(guān)報道也有很多。Chhokar等［23］研究表明 Ca2+、Fe2+、Cu2+、Cu1+對酶活有促進作用，然而Hg2+、Na+、K+、Zn2+、Ag+、Mg2+、Cd2+對酶活有抑制作用;異戊醇、甲醇、乙醇、苯、甲苯、丙三醇等有機溶劑對單寧酶有抑制作用，表面活性劑如吐溫-80、吐溫-20、EDTA也有抑制效果，但是SDS可增強單寧酶活力。Qiu等［27］從橡椀果子分離得到的郝克氏青霉菌產(chǎn)單寧酶，F(xiàn)e3+、Zn2+、DTT、β-巰基乙醇、乙醇等對單寧酶有抑制作用，而K+、Mn2+、吐溫-80、Triton-100等對其有促進作用。Kar等［26］研究金屬離子對米根霉單寧酶的影響，發(fā)現(xiàn)Mg2+、Hg+對單寧酶活性有促進作用，但是Ba2+、Ca2+、Zn2+、Hg2+、Ag+有抑制作用，F(xiàn)e3+和Co2+對單寧酶完全抑制。另外，Marco等［30］發(fā)現(xiàn)Fe3+對黑曲霉GH1單寧酶也有完全抑制作用，Cu2+和Zn2+抑制效果較小，Co2+有很強的促進作用。由上述研究可知，由于單寧酶的來源不同，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能存在差異，導(dǎo)致金屬離子、表面活性劑以及有機溶劑對其的影響效果也不盡相同。

5 單寧酶分子生物學(xué)的相關(guān)研究

有關(guān)單寧酶分子生物學(xué)的相關(guān)研究近年來報道較少。Hatamoto等［31］早在1996年就對來自米曲霉的單寧酶基因進行了研究，發(fā)現(xiàn)該單寧酶基因沒有內(nèi)含子，可編碼588個氨基酸序列，分子量為64 ku。把此單寧酶基因克隆到其他產(chǎn)單寧酶菌株，拷貝數(shù)和酶活力成正比。Albertse等［32］從黑曲霉克隆單寧酶基因，并在釀酒酵母中表達，重組體單寧酶與其他單寧酶的比較研究結(jié)果顯示:重組體單寧酶表達量很低，可能在酵母菌中表現(xiàn)出過糖基化現(xiàn)象。Iwamoto等［33］第一次從除葡萄球菌之外的其他細菌—乳酸桿菌中克隆出單寧酶基因tanLpl。SDS-PAGE分析顯示，純化的tanLpl蛋白是個單體多肽，分子量約為50 ku。對于不同來源的單寧酶基因的差異和聯(lián)系有待深入研究。

近些年，基因工程技術(shù)在產(chǎn)單寧酶微生物育種方面的應(yīng)用也有報道，獲得了一些遺傳特性穩(wěn)定、酶活力較高的高產(chǎn)菌株(表3)。

表3 單寧酶微生物育種相關(guān)研究Table3 The tannase microbial breeding research

由表3可看出，通過基因工程技術(shù)在單寧酶微生物育種方面有一定的進展，與原始菌株相比酶活力都有所提高，不同來源的產(chǎn)單寧酶菌株，其編碼單寧酶的基因的特征也是有差異的。

6 總結(jié)和展望

近年來在單寧酶及其應(yīng)用研究方面雖然有了一定的進展，但是受到生產(chǎn)、回收、純化的高成本，以及生產(chǎn)工藝條件不成熟等因素的影響，單寧酶的生產(chǎn)和應(yīng)用受到限制，因而還未能形成大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。從表1可知，微生物單寧酶具有廣泛的來源，進一步發(fā)掘微生物資源，開發(fā)微生物單寧酶，將為單寧酶的產(chǎn)業(yè)化創(chuàng)造條件。從已有的文獻報道可知，固體發(fā)酵產(chǎn)單寧酶比液體發(fā)酵更有優(yōu)勢。但近年來由于新的生物反應(yīng)器的出現(xiàn)，對2種發(fā)酵方式產(chǎn)單寧酶都有所提高，也為單寧酶的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。目前的趨勢是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)和工業(yè)發(fā)酵技術(shù)相結(jié)合，來提高單寧酶的產(chǎn)量和降低成本。需要做的是確立一個微生物表達載體，需要發(fā)展低成本的微生物發(fā)酵工藝，并提高單寧酶的固定化等。對單寧酶的蛋白結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)工程方面的相關(guān)研究，也有助于增強單寧酶活力水平。單寧酶可以作用于某些特定的底物，根據(jù)不同需要研究單寧酶對這些底物的生物轉(zhuǎn)化，可以為人類提供特殊的代謝產(chǎn)物。但是，單寧酶生物轉(zhuǎn)化單寧的生化過程還不是很清楚，有待更深入的研究。

［1］Aguilar，C.and G.Gutirrez-Senchez.Review:sources，properties，applications and potential uses of tannin acyl hydrolase［J］.Food Science and Technology International，2001，7(5):373-382.

［2］Aguilar，C.N.，et al.Production of tannase byAspergillus nigerAa-20 in submerged and solid-state fermentation:influence of glucose and tannic acid［J］.Journal of industrial microbiology ＆ biotechnology，2001，26(5):296-302.

［3］Aguilar，C.N.，et al.Microbial tannases:advances and perspectives［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，76(1):47-59.

［4］Bhat，T.K.，B.Singh，and O.P.Sharma.Microbial degradation of tanninsa current perspective［J］.Biodegradation，1998，9(5):343-357.

［5］Chávez-González，M.，et al..Biotechnological Advances and Challenges of Tannase:An Overview［J］.Food and Bioprocess Technology，2011，5(2):445-459.

［6］Barthomeuf，C.，F(xiàn).Regerat，and H.Pourrat，Production，purification and characterization of a Tannase fromAspergillus nigerLCF 8［J］.Journal of fermentation and bioengineering，1994，77(3):320-323.

［7］Lekha，P.K.and B.K.Lonsane.Comparative titres，location and properties of tannin acyl hydrolase produced byAspergillus nigerPKL 104 in solid-state，liquid surface an submerged fermentations［J］.Process Biochemistry，1994，29(6):497-503.

［8］Cruz-Hernendez，M.，et al.Evaluation of culture conditions for tannase production byAspergillus nigerGH1［J］.Food Technology and Biotechnology，2006，44(4):541-544.

［9］Renovato，J.，et al.Differential properties ofAspergillus nigertannase produced under solid-state and submerged fermentations［J］.Appl Biochem Biotechnol，2011，165(1):382-395.

［10］Bradoo，S.，R.Gupta，and R.K.Saxena.Parametric optimization and biochemical regulation of extracellular tannase fromAspergillus japonicus［J］.Process Biochemistry，1997，32(2):135-139.

［11］劉如石，謝達平，等.Asp.nigerNo.3液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶條件的研究［J］.食品科學(xué)，2001，22(2):28-32.

［12］Battestin，V.and G.A.Macedo.Tannase production byPaecilomyces variotii［J］.Bioresour Technol，2007，98(9):1832-1837.

［13］保玉心，等.固態(tài)發(fā)酵黑曲霉產(chǎn)單寧酶發(fā)酵條件研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34(6):54-56，61.

［14］Costa，A.M.，et al.Production of tannase byAspergillus tamariiin submerged cultures［J］.Brazilian Archives of Biology and Technology，2008，51(2):399-404.

［15］Manjit，et al.Tannase production byAspergillus fumigatusMA under solid-state fermentation［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24(12):3023-3030.

［16］谷文，楊亦陳，王石發(fā)，等.產(chǎn)單寧酶真菌的篩選及產(chǎn)酶條件［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2010，34(03):6-10.

［17］王征，謝達平，譚周進，等.黑曲霉單寧酶提純及其性質(zhì)的研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2001，27(1):60-62.

［18］劉如石，邱義蘭，謝達平，等.Asp，NigerNo.3單寧酶純化及性質(zhì)的研究［J］食品與機械，2000，(4):15-16.

［19］Ramirez-Coronel，M.A.A novel tannase fromAspergillus nigerwith glucosidase activity［J］.Microbiology，2003，149(10):2941-2946.

［20］Sharma，S.，L.Agarwal，and R.K.Saxena.Purification，immobilization and characterization of tannase fromPenicillium variable［J］.Bioresour Technol，2008，99(7):2544-2551.

［21］Gaikaiwari，R.P.，S.A.Wagh，and B.D.Kulkarni.Extraction and purification of tannase by reverse micelle system［J］.Separation and Purification Technology，2012，89:288-296.

［22］Mahendran，B.，N.Raman，and D.J.Kim.Purification and characterization of tannase fromPaecilomyces variotii:hydrolysis of tannic acid using immobilized tannase［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2006，70(4):444-450.

［23］Chhokar，V.，et al.Purification and characterization of extracellular tannin acyl hydrolase fromAspergillus heteromorphusMTCC 8818［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2010，15(5):793-799.

［24］Sharma，K.P.and P.J.John.Purification and characterization of tannase and tannase gene fromEnterobactersp.［J］.Process Biochemistry，2011，46(1):240-244.

［25］Sivashanmugam，K.and G.Jayaraman.Production and partial purification of extracellular tannase byKlebsiella pneumoniaeMTCC 7162 isolated from tannery effluent［J］.African Journal of Biotechnology，2011，10(8):1364-1374.

［26］Kar，B.，R.Banerjee，and B.Bhattacharyya.Effect of additives on the behavioural properties of tannin acyl hydrolase［J］.Process Biochemistry，2003，38(9):1285-1293.

［27］Qiu，Y.et al.Properties and secondary structure of tannase fromPenicillium herquei［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2011，16(5):858-866.

［28］Abdolhassan，K.，A.Z.Mohammad，and J.Abbsali.Identification，isolation，cloning and sequencing of tannase gene fromAspergillus niger［J］.Jundishapur Journal of Microbiology，2012，4(2(supl)):465-471.

［29］Da Costa，A.M.，et al.Production，purification and characterization of tannase fromAspergillus tamarii［J］.African Journal of Biotechnology，2012，11(2):391-398.

［30］Marco，M.，et al.A novel tannase from the xerophilic fungusAspergillus nigerGH1［J］.J Microbiol Biotechnol，2009，1:1-10.

［31］Hatamoto，O.，et al.Cloning and sequencing of the gene encoding tannase and a structural study of the tannase subunit fromAspergillus oryzae［J］.Gene，1996，175(1):215-221.

［32］Albertse，E.H et al.Cloning，expression and characterization of tannase fromAspergillus species［D］.South Africa:University of the Free State，2002.

［33］Iwamoto，K.，et al.Identification and cloning of a gene encoding tannase(tannin acylhydrolase)fromLactobacillus plantarumATCC 14917(T)［J］.Syst Appl Microbiol，2008，31(4):269-277.

［34］Zhong，X.，et al.Secretion，purification，and characterization of a recombinantAspergillus oryzaetannase in Pichia pastoris［J］.Protein expression and purification，2004，36(2):165-169.

［35］黃小鳳，韋宇括，韋傳東，等.單寧酶基因在黑曲霉st31中的克隆與表達［J］.中國生物工程雜志，2005，25(9):74-77.

［36］Yu，X.W.and Y.Q.Li.Expression of Aspergillus oryzae tannase in Pichia pastoris and its application in the synthesis of propyl gallate in organic solvent［J］.Food Technology and Biotechnology，2008，46(1):80-85.

［37］Boer，E.，et al.Atan1p-an extracellular tannase from the dimorphic yeast Arxula adeninivorans:molecular cloning of the ATAN1 gene and characterization of the recombinant enzyme［J］.Yeast，2009，26(6):323-337.

［38］Antonio Curiel，J.，et al.Production and Physicochemical Properties of Recombinant Lactobacillus plantarum Tannase［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57(14):6224-6230.

［39］Boer，E.，et al.Large-scale production of tannase using the yeast Arxula adeninivorans［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2011，92(1):105-14.

［40］吳明波，彭小紅，溫華，等.乳酸桿菌中單寧酶基因的克隆、表達與純化［J］.四川大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2012，49(2):479-483.