實驗室2種檢測小兒巨細(xì)胞病毒方法的比較

李 嬌，馬洪剛，單風(fēng)平*

(1.中國醫(yī)科大學(xué) 免疫教研室，遼寧 沈陽 110001;2.沈陽市兒童醫(yī)院檢驗科，遼寧 沈陽 110001)

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是一類在自然界普遍存在，但又具有嚴(yán)格種屬特異性的病毒。人類HCMV感染非常普遍，并且是人巨細(xì)胞病毒的唯一宿主［1］。初次感染多在2歲以下，大多呈隱性或潛伏感染，但在一定條件下侵襲多個器官和系統(tǒng)可產(chǎn)生嚴(yán)重疾病。小兒機(jī)體阻抑HCMV的入侵能力極弱，故很容易受感染，尤其是胎兒及免疫力低下的嬰兒更易受其侵害。HCMV感染即便有癥狀，也無特征性，要確診HCMV感染，主要依靠實驗室檢查［2］。病毒分離雖為金標(biāo)準(zhǔn)，但HCMV分離培養(yǎng)困難，費時耗力，臨床應(yīng)用較少。臨床一般用血清學(xué)方法和分子生物方法輔助診斷。目前較多實驗室采用ELISA或膠體金法檢測血清中特異性人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)抗體，但檢出率較低且只能定性。PCR熒光檢測定量準(zhǔn)確，是值得推廣的一種技術(shù)手段。本文將膠體金和PCR 2種方法進(jìn)行對比分析，為HCMV感染的診斷提供及時準(zhǔn)確的實驗室結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對象 本研究收集2012年4月至2012年10月因新生兒肺炎，支氣管炎，腸炎，新生兒黃疸等病因在我院住院的243例疑似HCMV感染的患兒，年齡為1 d～9個月，男∶女為146∶97;診斷標(biāo)準(zhǔn)參考CMV感染診斷方案［3］。

1.1.2 標(biāo)本采集 空腹抽取患兒靜脈血2 mL置于滅菌的一次性非抗凝試管中，取分離出的血清0.2 mL密閉送檢。溶血標(biāo)本應(yīng)重新抽取血樣，若甘油三酯含量超過6 mmol/L或肉眼可見血清呈白色混濁狀的標(biāo)本，應(yīng)4℃ 13 000 r/min離心15 min，吸取下層清亮血清送檢。血清標(biāo)本在2～8℃可放置72 h，－70℃可長期保存，標(biāo)本不宜反復(fù)凍融。

1.1.3 儀器與試劑 HCMV-IgM試劑盒由艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司生產(chǎn)，HCMV-DNA采用美國ABI 7300 Real-time PCR system分析儀，試劑盒購自上海之江生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HCMV-IgM檢測 膠體金法檢測血清中特異性HCMV-IgM，操作和結(jié)果的判斷嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，20 min內(nèi)出現(xiàn)2條紫紅色條帶(一條位于測試區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi))為陽性。在測試區(qū)內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)，僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色條帶為陰性。質(zhì)控區(qū)未出現(xiàn)紫紅色條帶，說明此試劑作廢。

1.2.2 HCMV-DNA 檢測 取血清50 μL置于1.5 mL無菌EppendoH離心管中，加入50 μL DNA專用提取液，震蕩10 s，99℃水浴10 min，取上清4 μL加入HCMV-DNA檢測體系中，在ABI 7300分析儀上進(jìn)行檢測。循環(huán)條件為37℃ 2 min，94℃ 2 min，循環(huán)1次，再按93℃ 15 s，60℃1 min，循環(huán)40次，單點熒光檢測在60℃，反應(yīng)體系為40 μL，;陰陽性對照、CMV DNA標(biāo)準(zhǔn)品(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)同時進(jìn)行檢測。擴(kuò)增結(jié)束后通過電腦分析得出定量結(jié)果。結(jié)果大于1 000拷貝/mL判定為陽性。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行配對資料的卡方檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對243例標(biāo)本的PCR法與膠體金法結(jié)果陽性率比較

243例標(biāo)本進(jìn)行熒光定量PCR檢測HCMVDNA，陽性率為11.93(29/243)，膠體金檢測HCMV-IgM，陽性率為6.58(16/243);血清HCMVDNA和HCMV-IgM檢測陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。2種檢測方法CMV-IgM陽性率比較，實時熒光定量PCR法陽性率高于膠體金法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

表1 2種檢測方法陽性率的比較Table1 The positive comparison of the two kinds of detection methods

29例HCMV-DNA陽性標(biāo)本中，HCMV-IgM陽性16例，HCMV-DNA在2.11×103～4.58×106拷貝/mL之間，平均3.43×105拷貝/mL。HCMV-IgM陰性13例，HCMV-DNA在1.25×103～5.30×105拷貝/mL之間，平均2.32×104拷貝/mL。比較二者平均拷貝數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 對243例標(biāo)本的PCR法與膠體金法結(jié)果敏感性比較

本研究243例患兒，結(jié)合臨床癥狀及相關(guān)檢查，診斷為CMV感染者40例，發(fā)病率為16.4%。2種檢測方法敏感性比較，見表2。

表2 2種檢測方法敏感性的比較Table2 The sensitivity comparison of the two kinds of detection methods

3 討論

兒童是HCMV感染的易感人群。研究發(fā)現(xiàn)，HCMV的組織嗜性與宿主年齡和免疫狀態(tài)密切相關(guān)［4-5］。HCMV感染主要集中在圍生期感染，這一感染可能與母乳等有關(guān)，通過母體病毒進(jìn)行傳播感染，一般圍生期HCMV感染主要通過乳汁、產(chǎn)道、血液制品等進(jìn)行直接傳遞。圍生期HCMV患者主要癥狀有:早產(chǎn)、聽力運動障礙、腦癱、癲癇、肝功能異常等現(xiàn)象［6］。HCMV患者中，中樞系統(tǒng)損害患者通常會伴有一些腦癱，智力低等后遺癥［7］。在臨床中，需要注意6個月以內(nèi)的嬰兒一般是HCMV的高發(fā)群體，其損害特征與嬰兒的年齡有一定的關(guān)系，較大一些的嬰兒主要體現(xiàn)為腦損害，較小的新生嬰兒(2～3個月)表現(xiàn)為高膽紅素血癥，而1～2個月的嬰兒多出現(xiàn)支氣管肺炎癥狀。HCMV具有潛伏-活化的生物學(xué)特性［8］，一旦侵入人體將長期或終身存在于體內(nèi)，區(qū)分HCMV的潛伏感染和活動性感染對臨床治療和判斷預(yù)后至關(guān)重要。3歲以內(nèi)嬰幼兒為HCMV活動性感染發(fā)生的高發(fā)年齡組［9］。目前HCMV-IgM抗體被用作實驗室診斷活動性HCMV感染的重要指標(biāo)之一［10］，其陽性提示近期有HCMV活動性感染。因此及早診治HCMV感染患兒，實驗室檢查尤其重要。病毒分離是診斷HCMV感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但不能滿足臨床需求。臨床實用的方法包括血清學(xué)測定HCMV特異抗體，即HCMV-IgM;熒光定量PCR技術(shù)測定血HCMV-DNA。近年來，隨著熒光定量PCR在臨床檢測的開展，越來越多的研究結(jié)果表明熒光定量PCR較傳統(tǒng)檢測方法具有更好的靈敏度和特異性［11-12］。而HCMV-IgM抗體檢測是診斷HCMV活動性感染的有效指標(biāo)，熒光定量PCR則是通過檢測HCMV-DNA水平，來監(jiān)測病毒活躍程度。HCMV-IgM特異性抗體是HCMV進(jìn)入機(jī)體后最先產(chǎn)生的抗體，它在體內(nèi)持續(xù)時期一般不超過4個月。從患者血清中檢出HCMVIgM抗體，就表明患者最近發(fā)生了原發(fā)性HCMV感染或活動性HCMV感染。使用血清學(xué)方法檢測HCMV-IgM實際上是檢測人體對HCMV感染的免疫反應(yīng)狀態(tài)，無法檢測病毒自身，也就無法更準(zhǔn)確靈敏地反映HCMV感染情況［13］。在免疫抑制狀態(tài)下，HCMV抗體產(chǎn)生常延遲或缺乏，影響陽性檢出率，因此血清抗HCMV-IgM對診斷HCMV感染有一定的局限性。實時熒光定量PCR(Realtime PCR)是進(jìn)行臨床基因診斷的新型定量檢測方法，不但具有PCR的高靈敏性、探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量的優(yōu)點，而且在檢測過程中采用閉管體系，以及全自動定量分析，不需要PCR后處理，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物污染造成的假陽性結(jié)果。Real-time PCR的另一個優(yōu)點是可以對HCMV進(jìn)行定量檢測，對長期使用免疫抑制劑的移植患者或特異性感染患者，可依據(jù)病毒荷載量的變化合理進(jìn)行臨床治療，并可更加有效地評估患者的治療效果［14］。

選擇臨床上243例小兒標(biāo)本，同時采用熒光定量PCR法和膠體金法檢測外周血中HCMVIgM的水平。其中實時熒光定量PCR法陽性率為11.93%，而膠體金法為6.58%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，進(jìn)一步分析，13例PCR法檢測陽性而膠體金法檢測陰性的患兒，其PCR法檢測的平均拷貝數(shù)為2.32×104拷貝/mL，說明了PCR法更具有準(zhǔn)確度。又對其敏感性進(jìn)行了比較，PCR法的敏感性為72.5%，膠體金法的敏感性為40.0%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，說明了PCR法更具有敏感度。在HCMVIgM抗體陽性患者中HCMV-DNA拷貝數(shù)平均值高于陰性患者(P＜0.05)，證實了HCMV-DNA定量檢測結(jié)果符合HCMV的致病機(jī)制即活動性HCMV感染中的病毒量高于潛伏性感染者。但由于兩組HCMV-DNA拷貝數(shù)重疊范圍大，未得到明確的DNA拷貝數(shù)界限預(yù)測HCMV活動性感染，國外研究顯示大于5×103具有較高的患巨細(xì)胞病毒病的風(fēng)險［15］。因此，血清HCMV-IgM對診斷HCMV感染有一定的局限性，利用實時熒光定量PCR定量檢測HCMV-DNA的方法比HCMV-IgM檢測能更靈敏地反映HCMV感染，對于小兒巨細(xì)胞病毒疾病診斷也更具有臨床價值，但是在時間及操作上，膠體金法更占有優(yōu)勢。

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