P物質(zhì)在慢性中耳炎肉芽及纖維組織中的表達(dá)及意義

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科（西安710004） 孫 斌 成 穎 許 珉

慢性中耳炎以肉芽組織形成為標(biāo)志，中耳粘連、聽骨破壞、鼓室硬化等頑固性病變與肉芽組織有關(guān)，因此對(duì)肉芽組織形成因素和病理行為的研究，是理解中耳炎病理的關(guān)鍵。P物質(zhì)（SP）是神經(jīng)源性炎癥中的一個(gè)重要介質(zhì)［1］，趨化炎性細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，并且促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，與肉芽組織的形成相關(guān)。本研究選取慢性中耳炎患者中耳組織標(biāo)本，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測SP在中耳炎性肉芽組織中的表達(dá)，探討SP在肉芽組織形成及轉(zhuǎn)化中的作用，揭示神經(jīng)源性炎癥對(duì)中耳炎性病變的影響，為認(rèn)識(shí)中耳炎的病變過程及發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸提供依據(jù)。

對(duì)象與方法

1 對(duì) 象 收集我院接受中耳手術(shù)治療的慢性中耳炎患者70例，均不伴膽脂瘤形成，男32例（32耳），女38例（38耳）；年齡6～78歲，平均33．6歲；左側(cè)33耳，右37耳；病程13月至45年，平均12．45年。獲取10例外耳道正常皮膚組織作為對(duì)照。

2 方 法 術(shù)后立即用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。選用兔抗人SP多克隆抗體，購自北京中杉金橋生物公司（ZA－0235）。檢測方法按照產(chǎn)品說明書過程進(jìn)行。石蠟切片5μm脫蠟至水，顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染、封片，顯微鏡觀察、計(jì)數(shù)并攝像。以正常外耳道皮膚作為陰性對(duì)照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，對(duì)不同病變程度患者SP表達(dá)情況用行×列表的χ2檢驗(yàn)及線性回歸分析；對(duì)SP在肉芽組織及纖維組織中表達(dá)對(duì)比用秩和檢驗(yàn)（Wilcoxon兩樣本比較法），P＜0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SP的表達(dá) 陽性對(duì)照呈明確的黃色或棕黃色染色；正常外耳道皮膚陰性對(duì)照呈淡黃色，為弱陽性。肉芽組織中SP要定位于肉芽組織中的炎性細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞）、成纖維細(xì)胞和血管壁的細(xì)胞漿中，呈棕黃染色，強(qiáng)陽性為主。纖維組織中定位于膠原纖維、炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管壁的細(xì)胞漿中，染色以黃色為主，部分標(biāo)本染色較弱。

2 病例資料分級(jí) 根據(jù)術(shù)前檢查、術(shù)中觀察及術(shù)后病理檢查所見，依據(jù)肉芽在中耳的增生程度，將標(biāo)本分為四級(jí)：一級(jí)，中耳腔無可見肉芽，黏膜輕度增厚，聽骨鏈完整，活動(dòng)可，患者平均聽閾≤30d B；二級(jí)，中耳腔肉芽僅侵及中耳鼓室、乳突、鼓竇、鼓竇入口及后鼓室等中的一個(gè)解剖區(qū)域，且聽骨鏈完整，活動(dòng)可，患者平均聽閾31～40d B；三級(jí)，肉芽侵及兩個(gè)解剖區(qū)域，且聽骨鏈活動(dòng)差，患者平均聽閾41～50d B；四級(jí)，肉芽侵及兩個(gè)以上解剖區(qū)域，或外耳道肉芽，聽骨鏈固定或中斷，患者平均聽閾＞50d B。各級(jí)標(biāo)本對(duì)應(yīng)的SP表達(dá)情況（見表1）。對(duì)中耳病變輕重程度與SP表達(dá)的關(guān)系行χ2檢驗(yàn)及線性回歸分析（見表2）得出P＜0．05，即SP與中耳病變級(jí)別存在相關(guān)關(guān)系，且為線性關(guān)系。即級(jí)別越高，病變?cè)街貏tSP表達(dá)越強(qiáng)。

表1 肉芽組不同病變程度標(biāo)本SP表達(dá)情況

表2 中耳病變輕重程度與SP表達(dá)的關(guān)系分析

3 SP在肉芽組織與纖維組織中的表達(dá) 見表3。肉芽組織50例，纖維組織20例，采用秩和檢驗(yàn)（Wilcoxon兩樣本比較法），μ＝3．4782，肉芽組織組P物質(zhì)表達(dá)高于纖維組織組（P＜0．05）。

表3 SP在肉芽組織及纖維組織中表達(dá)情況

討 論

SP是除經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)（乙酰膽堿、單胺類、氨基酸）外的第三類神經(jīng)活性物質(zhì)，SP與其受體結(jié)合作用于效應(yīng)細(xì)胞，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。其受體分為 NK1、NK2和NK3三型，SP對(duì)NK1受體親和力較高。按其分布部位和作用方式的不同SP起著神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)質(zhì)或激素樣作用。SP能以神經(jīng)內(nèi)分泌的方式作用于各種免疫細(xì)胞參與免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)免疫功能［2］。同時(shí)，受各種刺激（物理、化學(xué)、生物性）時(shí)，SP可逆向性的釋放進(jìn)入局部組織中，組成了神經(jīng)源SP介人炎癥反應(yīng)的解剖和生理基礎(chǔ)。研究表明，低劑量SP能直接作用于血管，而較高濃度時(shí)SP可再借助于其誘導(dǎo)產(chǎn)生的其它炎性介質(zhì)而形成雙重效應(yīng)［3］。導(dǎo)致炎癥局部血管擴(kuò)張、血漿滲出。SP對(duì)多型核白細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞具有趨化性或增強(qiáng)其它趨化因子對(duì)這些細(xì)胞的趨化作用，將炎性細(xì)胞保持在炎癥部位，有助于炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)生。SP能通過釋放炎性代謝產(chǎn)物直接影響巨噬細(xì)胞的功能。SP可刺激巨噬細(xì)胞的聚集、吞噬和趨化［4］，增加炎癥調(diào)控因子IL－1的釋放，強(qiáng)化LPS誘導(dǎo)的IL－6和TNF－α的釋放。T淋巴細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)的黏附是使得它們能夠滲出血管到達(dá)炎癥部位發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。SP可劑量和時(shí)間依賴性提高內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞的黏附力，且可通過T淋巴細(xì)胞表達(dá)其特異性受體而獲得促黏附或抗黏附信號(hào)，從而調(diào)節(jié) T淋巴細(xì)胞的功能［5］。肥大細(xì)胞上有神經(jīng)肽受體 NK1存在［6］，SP與神經(jīng)肽受體結(jié)合后促使肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組織胺、血清素、一氧化氮等，使血管擴(kuò)張和血漿溢出，而肥大細(xì)胞釋放的組織胺也可調(diào)節(jié)SP的水平［7］。在肥大細(xì)胞釋放的顆粒中含有如 TGF－β、TNF－α、b FGF、IL－1、IL－3、IL－4、IL－6等細(xì)胞因子，這些因子參與了炎癥反應(yīng)并可刺激修復(fù)細(xì)胞遷移、增殖和膠原合成。其中的IL－1、腫瘤壞死因子對(duì)成纖維細(xì)胞的增生和膠原的合成有雙向調(diào)節(jié)作用［8］，而TGF－β能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，趨化成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞到損傷部位，加速創(chuàng)傷部位纖維化。巨噬細(xì)胞也可以通過將抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞釋放的淋巴因子IL－2、IL－6和TGF－β具有確定的促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原沉積的作用。研究表明，SP在體外對(duì)肉芽組織成纖維細(xì)胞具有顯著的促增殖作用［9］，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴特性。受刺激的成纖維細(xì)胞還吸引大量的炎細(xì)胞浸潤，聚集并產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子反過來又刺激成纖維細(xì)胞的增生與分化，并分泌一些細(xì)胞外基質(zhì)成分，由此產(chǎn)生惡性循環(huán)，形成肉芽。

滲出液和肉芽是中耳炎患者中耳腔中的常見病變，Sady等［10］顳骨病理切片研究發(fā)現(xiàn)肉芽組織在中耳腔的發(fā)生率可達(dá)97．2%，滲出液的發(fā)生可達(dá)89．6%；Vikra m等［11］觀察150例中耳炎顳骨病理切片發(fā)現(xiàn)滲出液和肉芽組織幾乎出現(xiàn)在所有慢性中耳炎病理切片中。說明慢性中耳炎最顯著的兩個(gè)病變就是中耳腔滲出液的積聚和肉芽組織的形成，而肉芽組織的形成是慢性中耳炎的特征性不可逆病理改變。慢性中耳炎主要是以肉芽組織形成為標(biāo)志的，許多象粘連、聽骨破壞、鼓室硬化等病變都與肉芽組織有關(guān)。SP存在于分泌性中耳炎（SOM）的中耳積液（MEE）中［12］，且漿液性MEE中SP含量明顯高于黏液組，MEE中SP濃度越高，作用越持久強(qiáng)烈，其病程發(fā)展則愈長。SP可以刺激中耳粘膜腺體，使其增生分泌亢進(jìn)。Nagaraj等［13］認(rèn)為中耳腔粘膜在炎癥條件下的滲出是一種積極的反應(yīng)，自主神經(jīng)和神經(jīng)肽在中耳炎的病理過程中起著重要作用。

本研究在慢性中耳炎的病理切片中觀察到炎性細(xì)胞在中耳黏膜下及肉芽中的浸潤，炎癥細(xì)胞主要為淋巴細(xì)胞，單核巨噬細(xì)胞，也可見少量多核白細(xì)胞。同時(shí)SP在慢性中耳炎的黏膜中有表達(dá)，主要在纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞、血管上皮及腺體細(xì)胞的胞漿中，呈明顯的黃色或棕黃染色。這些細(xì)胞均存在NK1受體，因此SP的高表達(dá)說明了神經(jīng)炎性介質(zhì)積極參與了中耳炎性過程，使炎癥細(xì)胞聚集、部分組織增生，同時(shí)產(chǎn)生大量的CK，這些CK又可刺激局部粘膜增生、損傷，吸引炎癥細(xì)胞在局部聚集，各類CK之間又可相互作用，如IL－1β、TNF－α、γ－INF等均可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生IL－6，IL－6又可抑制TNF－α的產(chǎn)生，TNF－α過高或過低都可導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)節(jié)紊亂。TNF－α又可以促進(jìn)IFN－γ的分泌，IFN－γ具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的作用，IL－1、TNF－α、LPS又可誘導(dǎo)IL－8的產(chǎn)生，它又可對(duì)中性白細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用。促使著炎性過程進(jìn)一步發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)病理標(biāo)本的肉芽組織中SP呈現(xiàn)了高表達(dá)，主要在纖維細(xì)胞、血管上皮等的胞漿中，并且SP的表達(dá)與病例資料分級(jí)存在相關(guān)關(guān)系，且為線性關(guān)系（χ2＝25．9919，ν＝9，P＜0．05），SP表達(dá)越強(qiáng)則級(jí)別越高。而我們的病例資料分級(jí)是以肉芽組織在中耳的增生程度為主要依據(jù)，因此，SP表達(dá)越強(qiáng)則中耳腔肉芽組織增生越多。說明神經(jīng)原性炎癥的強(qiáng)弱影響著中耳腔肉芽組織的增生程度。受SP趨化的炎性細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子等誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的增生和膠原的合成，并分泌一些細(xì)胞外基質(zhì)成分，吸引大量的炎細(xì)胞浸潤，聚集并產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，由此產(chǎn)生惡性循環(huán)，使纖維母細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞旺盛增生，并以小動(dòng)脈為軸心，在周圍形成袢狀彎曲的毛細(xì)血管網(wǎng)，與纖維母細(xì)胞一起構(gòu)成小團(tuán)塊，形成了肉芽。張全安等［14］對(duì)中耳炎顳骨切片觀察顯示：咽鼓管黏膜幾乎無炎性病理改變；前半－后下中鼓室區(qū)病變很輕；聽骨鏈區(qū)病變最重；鼓竇－乳突區(qū)病變也很重。筆者認(rèn)為：因?yàn)橹卸磺安繀^(qū)域黏膜下缺少神經(jīng)和血管，不易使由神經(jīng)肽介導(dǎo)的神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)在中耳黏膜下發(fā)生；而中耳腔后部區(qū)域黏膜下富于神經(jīng)和血管，這為SP介導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)提供了解剖基礎(chǔ)，是SP在多方面參與了中耳炎癥反應(yīng)的有力證據(jù)。中耳腔肉芽組織逐漸纖維化，病變靜止，本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析肉芽組織組SP表達(dá)高于纖維組織組（μ＝3．4782，P＜0．05），說明由SP介導(dǎo)的神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)在中耳腔已經(jīng)減弱。

SP作為一種具有多方面生理學(xué)效應(yīng)的神經(jīng)肽，參與了神經(jīng)炎癥反應(yīng)的全過程。它不僅作為感覺神經(jīng)上行傳導(dǎo)傷害性刺激的物質(zhì)基礎(chǔ)，而且直接或間接作用于成纖維細(xì)胞，直接參與到中耳炎的免疫炎癥反應(yīng)和炎性肉芽形成和轉(zhuǎn)歸的過程中，并在其中起了十分重要的作用。可以認(rèn)為SP具有感受和防御各種傷害性刺激，與其它機(jī)制共同調(diào)節(jié)機(jī)體平衡，具有非常重要的作用。

［1］Mehillis JP，Mitsusashi M，Payan AD．Immunno modulation by tachykinin neuropeptides［J］．Ann NY Acad Sci，1990，594：85．

［2］張萬會(huì)，朱運(yùn)龍．P物質(zhì)的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)［J］．生理科學(xué)進(jìn)展，1992，23（2）：116．

［3］Kraneveld AD，Buckley TL，Heuven－Nolsen D，et al．Delayed－type hypersensitivity－induced increase in vascular per meability in the mouse s mall intestine：inhibition by depletion of sensor y neuropeptides and NK1receptor blockade［J］．Br JPhar macol，1995，114（7）：1483－1489．

［4］Ichinose M，Sawads M．Enhancement of phagocyte by calcitionin gene－related peptide in cultured mouse peritoneal macrophages［J］．Peptides，1996，17（8）：1405－1414．

［5］Vishwanath R，Mukherjee R．Substance P pr o mototes ly mphocyte－endothelial cell adhesion preferentially via LFA－1/ICA M－1interactions［J］．J Neuroi mmunol，1996，71（1－2）：163－171．

［6］Cao T，Gerar d NP，Brain SD，et al．Use of NK1knockout mice to analyze substance P－induced ede ma for mation［J］．Am J Physiol，1999，277（2）：476－81．

［7］Hua XY，Back SM，Tam EK．Substance P enchances electrical filed sti mulation－induced mast cell gegranulation in rat trachea［J］．Am J Physiol，1996，270：L985－L991．

［8］Har brecht BG，Karen L．Nitric oxide and prostaglandins interact to prevent hepatic da mage during murine endotoxemia［J］．Am J Physiol，1994，266（29）：1004－1011．

［9］Rameshwar P，Poddar A，Zhu G，et al．Receptor induction regulates the synergistic effects of substance P with IL－1 and platelet－derived growth factor on the proliferation of bone marrow fibroblasts［J］．J Immunol，1997，158（7）：3417－24．

［10］Sady S，Michael MV，Paparelle MD，et al．Te mporal bone histopathology in chronically infected ears intact and perf orated ty mpanic membrane［J］．Laryngoscope，1992，102：1229－1236．

［11］Vikra m J，Jaisinghani MD，Michael MV，et al．Ty mpanic me mbrane/middle ear pathologic correlates in chronic otitis media［J］．Laryngoscopy，1999，109：712－716．

［12］王貴鋒．分泌性中耳炎中耳積液中P物質(zhì)含量與臨床相關(guān)性研究［J］．臨床耳鼻咽喉科雜志，2005，19（22）：1026－1028．

［13］Nagaraj BS，Lingthicu m FH Jr．Autonomic innervation of the hu man middle ear：Ani mmunohistoche mical st udy［J］．Am J Otolar yngol，1998，19（2）：75－82．

［14］張全安，張曉彤．中耳炎區(qū)域性病理差異現(xiàn)象的研究及臨床意義［J］．中華耳鼻咽喉科雜志，2004，39（9）：534－537．