HPLC法同時(shí)測定復(fù)方青黛膠囊中靛藍(lán)、靛玉紅的含量

楊海燕 張 成 任蕓倩 陜西省食品藥品檢驗(yàn)所（西安710065）

復(fù)方青黛膠囊是由青黛、馬齒筧、白芷等十四味中藥組成的復(fù)方制劑，具有清熱解毒、化瘀消斑，祛風(fēng)止癢等功效，臨床主要用于進(jìn)行期銀屑病、玫瑰糠疹、藥疹等。其中青黛為君藥，是一類常用中藥材［1］，青黛中主要成分為靛藍(lán)和靛玉紅，《中國藥典》2010年版一部青黛項(xiàng)下對(duì)靛藍(lán)、靛玉紅進(jìn)行了不同方法的測定［2］，比較繁瑣，且靛藍(lán)和靛玉紅可以互相轉(zhuǎn)化，分別測定兩個(gè)組分并不能真實(shí)的反映青黛中兩組分的實(shí)際含量。本方法在同一色譜條件下，同時(shí)測定靛藍(lán)和靛玉紅的含量，比較真實(shí)地反映出樣品中實(shí)際的含量，提高了檢驗(yàn)的工作效率，降低了成本，保證了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器 島津2010C HT 型高效液相色譜儀，島津2550 型紫外－可見分光光度計(jì)，Sartorius BP211D 型電子分析天平，

1.2 試 藥 靛藍(lán)、靛玉紅對(duì)照品均由中國藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)分別為：110716－200610、110717－200204；甲醇：（色譜純）；其余試劑均為分析純；復(fù)方青黛膠囊（陜西天寧制藥有限責(zé)任公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Kro－mosil C18色譜柱（5μm，4.6mm×250mm）；流動(dòng)相：甲醇－0.1%磷酸溶液（65∶35）；流速：1.0mL／min；柱溫：30℃。檢測波長293nm［3］。理論板數(shù)按靛藍(lán)峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.2 溶液的制備 2.2.1 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取靛藍(lán)、靛玉紅對(duì)照品適量，加N，N－二甲基甲酰胺［3］制成每1mL 含靛藍(lán)50μg、靛玉紅5μg的混合溶液，搖勻，即得。

2.2.2 樣品溶液的制備：取本品內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加N，N－二甲基甲酰胺25mL，稱定重量，超聲處理60 分鐘，放冷，稱定重量，用N，N－二甲基甲酰胺補(bǔ)足減失的重量，離心，取上清液，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法 2.3.1 專屬性試驗(yàn)：取按標(biāo)準(zhǔn)處方量及制法制得不含青黛的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液，各進(jìn)樣10μL 測定，結(jié)果陰性無干擾。表明方法專屬性好。對(duì)照品、樣品、陰性樣品色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品、樣品、陰性對(duì)照品色譜圖（1.靛藍(lán)，2.靛玉紅）

2.3.2 線性考察：精密吸取混合對(duì)照品溶液（每1mL含靛藍(lán)0.0515mg／mL，靛玉紅0.00601mg／mL）1，2，5，8，10，12，15，20，25μL進(jìn)樣，測定。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果靛藍(lán)在進(jìn)樣量為0.0515～1.2875μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，直線方程為：y＝5.4132×106x＋73710，r＝0.9997；靛玉紅在進(jìn)樣量為0.00601～0.1502μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，直線方程為：y＝5.7191×106x＋2919，r＝0.9999。結(jié)果表明峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度考察：精密吸取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值，結(jié)果峰面積RSD 靛藍(lán)為0.73%，靛玉紅為0.38%，結(jié)果表明本方法精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察：精密吸取供試品溶液，每隔4h進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值，結(jié)果在20h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，峰面積積分值RSD 靛藍(lán)為1.47%，靛玉紅為0.11%。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)：取批號(hào)為110412的樣品6份，按含量測定方法測定，靛藍(lán)的平均含量為1.7413mg／g，RSD 為2.47%；靛玉紅的平均含量為0.2339mg／g，RSD 為1.73%。結(jié)果表明，本法重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率：取已知含量的樣品（批號(hào)：110412，每1g含靛藍(lán)1.7413mg，靛玉紅0.2339mg），研細(xì)，取細(xì)粉約0.25g，精密稱定，精密加入濃度為0.0821mg／mL 的靛藍(lán)對(duì)照品溶液5mL，濃度為0.01372mL 的靛玉紅對(duì)照品溶液5mL，再精密加入N，N－二甲基甲酰胺15mL，同法進(jìn)行含量測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1、2。

表1 靛藍(lán)回收率測定結(jié)果

表2 靛玉紅回收率測定結(jié)果

2.3.7 青黛藥材含量測定：精密稱取青黛約0.05g，同法進(jìn)行含量測定，結(jié)果6批藥材的含量分別為2.91%、3.02%、3.00%、2.90%、2.88%、2.74%均符合規(guī)定。

2.3.8 復(fù)方青黛膠囊含量測定：取樣品0.5g，同法進(jìn)行含量測定，11批樣品測定結(jié)果最低為1.04mg／粒，最高為1.72mg／粒。所以暫將限度定為每粒含青黛以靛藍(lán)（C16H10N2O2）與靛玉紅（C16H10N2O2）的總量計(jì)，不得少于1.00mg。結(jié)果見表3。

表3 含量測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

供試品溶液的制備曾參照《中國藥典》2010年一部復(fù)方青黛丸含量測定方法［2］制備，結(jié)果靛藍(lán)和靛玉紅總量明顯小于本實(shí)驗(yàn)提取方法，且提取時(shí)間過長。

通過對(duì)超聲處理時(shí)間進(jìn)行考察，選擇含量最高超聲處理60min；通過對(duì)提取溶劑體積進(jìn)行考察，選擇含量最高的25mL。

實(shí)驗(yàn)過程中，采用Kromasil C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱和Inertsil ODS－3C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，均得到了較好的分離。

在實(shí)驗(yàn)的過程中發(fā)現(xiàn)，樣品溶液如果長時(shí)間暴露在強(qiáng)光下，靛玉紅和靛藍(lán)的含量會(huì)發(fā)生變化，靛藍(lán)含量有輕微的減小趨勢，靛玉紅含量則稍有增大的趨勢，而且溶液濃度越小越明顯，所以建議實(shí)驗(yàn)過程中盡量避光操作。

［1］ 謝友良，何百寅，李遠(yuǎn)彬，等.青黛藥材中的靛藍(lán)和靛玉紅含量的同時(shí)測定［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22（4）：452－455.

［2］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：185.

［3］ 張青松，尹文清，陳柳生.青黛中靛玉紅提取溶劑的改進(jìn)［J］.廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，13（3）：324－326.