原兒茶醛對大鼠心肌缺血／再灌注損傷的保護(hù)作用研究

袁曉峰 王 軍 周 丹 中國人民解放軍沈陽軍區(qū)赤峰醫(yī)院藥劑科（赤峰024000）

缺血性心臟病已成為危害人類健康的第一殺手。隨著冠狀動脈內(nèi)溶栓和冠脈搭橋等內(nèi)外科治療手段的廣泛應(yīng)用，繼之出現(xiàn)的心肌缺血／再灌注（myocardia1ischemia／rePerfusion，MI／R）損傷日益受到心臟病學(xué)家的高度重視。研究表明，氧化應(yīng)激［1，2］在MI／R 損傷中發(fā)揮著重要的作用。中藥治療MI／R損傷療效確切、前景良好。許多從中藥中分離得到的化合物都具有抗MI／R 損傷的作用，其中對于丹參心肌保護(hù)作用的研究最為引人關(guān)注。

丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根及根莖。近年來，臨床觀察和動物實驗都證明丹參具有廣泛而復(fù)雜的藥理活性［3，4］。原兒茶醛是丹參中結(jié)構(gòu)最簡單的主要成分，具有鄰二酚的母核結(jié)構(gòu)，該藥效基團(tuán)是其顯著抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)［5］。因此，我們推測該藥物具有保護(hù)MI／R 損傷的作用。本實驗旨在研究原兒茶醛對大鼠MI／R 損傷的保護(hù)作用。

1 材料 1.1動物 SD 雄性大鼠，250±20g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。實驗期間提供足量的自來水及實驗動物中心提供的普通飼料，動物室保持22℃，自然通風(fēng)，相對濕度60%～70%，光照周期8：00～20：00。適應(yīng)7d后用于實驗。

1.2 藥物與試劑 原兒茶醛購自貴州迪達(dá)科技有限公司；肌酸激酶同工酶（creatine kinase－MB，CK－MB），肌鈣蛋白（cardiac troPonin，cTnI）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）等試劑盒由上海西唐生物技術(shù)公司提供；2，3，5－氯化三苯基四氮唑藍(lán)（Tetrazolium chloride，TTC）染色劑由中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司提供；伊文思藍(lán)（Evans Blue，EB）由美國Sigma－Aldrich公司提供。

1.3 主要儀器 HX－100E小動物呼吸機(jī)（成都泰盟科技有限公司）；TDZ4A－WS低速臺式離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；COOLPIX S1 型照相機(jī)（Nikon公司，日本）；5417型低溫高速離心機(jī)（EPPendorf公司）。

2 方法 2.1 大鼠MI／R 模型制備 大鼠稱重后，2 mL／kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉，仰臥位固定，連接心電圖監(jiān)測，氣管插管并接呼吸機(jī)（頻率：75次／min；潮氣量：8～9 mL；吸：呼＝1：2），胸骨左緣旁縱行切開第3～5肋間做橫行切口，剪開并挑起心包，暴露心臟，以左心耳與肺動脈圓錐交界處的左冠狀動脈前降支（Left anterior descending coronary aery，LAD）為標(biāo)志，于左心耳下方1～2mm 處進(jìn)針、穿線（橫跨左冠狀動脈前降支），將一小硅膠管從絲線兩端穿入，穩(wěn)定10 min后結(jié)扎，缺血30 min后，再灌注3h 結(jié)束。成功標(biāo)準(zhǔn)［7］：結(jié)扎LAD 后心電圖II導(dǎo)聯(lián)ST 段出現(xiàn)弓背向上抬高，T 波高聳等為缺血成功；放松結(jié)扎線后，抬高的ST 段下降1／2以上為再灌注成功。假手術(shù)組動物只穿線，不結(jié)扎，其余兩組均進(jìn)行30 min缺血和3h再灌注。

2.2 實驗動物分組 將大鼠隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組，模型組，原兒茶醛組（5，10，20 mg／kg）。假手術(shù)組穿線，但不結(jié)扎；模型組頸靜脈注射生理鹽水，給藥組給予頸靜脈注射原兒茶醛水溶液。給藥時間為再灌注即刻。

2.3 心肌梗死面積測定［6］再灌注3h后，再次結(jié)扎各組大鼠左冠狀動脈前降支，從頸動脈迅速注入3% EB 溶液2 mL，待大鼠口唇及四肢末梢皮膚藍(lán)染后迅速摘除心臟，濾紙吸除心室腔中殘余染液，－80℃凍存。取出后自心尖向心底平行房室溝方向?qū)⑵淝谐上嗟群穸鹊?片，2%TTC溶液（PH＝7.4）37℃孵育10min，4%多聚甲醛固定過夜。染色后白色代表梗塞區(qū)（area of necrosis，AN），紅色代表缺血但未梗塞區(qū)，藍(lán)色代表正常區(qū)，危險區(qū)（area at risk，AAR）為紅色和白色面積之和［7，8］。采用Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。梗塞程度采用梗塞區(qū)面積（AN）與危險區(qū)面積（AAR）的比值表示。

2.4 血清生化指標(biāo)測定 再灌注3h后，腹主動脈取血，分離血清，離心（4000r／min）12 min，試劑盒檢測CK－MB，cTnI和LDH 的活性。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)均表示為，使用ANOVA 進(jìn)行多組均數(shù)之間差別的統(tǒng)計學(xué)檢驗，兩兩比較采用LSD 法。采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果 3.1 原兒茶醛對MI／R 損傷大鼠心肌梗塞面積的影響 模型組心肌梗塞面積嚴(yán)重，給予原兒茶醛后，給藥組梗塞面積有所下降。原兒茶醛（10）及原兒茶醛（20）兩個劑量組與模型組比較，梗塞面積均降低（P ＜0.05）。詳見圖1，表1。

圖1 原兒茶醛對大鼠MI／R 損傷心肌梗塞面積的影響

表1 原兒茶醛對大鼠MI／R 損傷心肌梗塞面積的影響（±s，n＝6）

表1 原兒茶醛對大鼠MI／R 損傷心肌梗塞面積的影響（±s，n＝6）

注：△P ＜0.05 vs 模型組。

組別模型組原兒茶醛（5）原兒茶醛（10）原兒茶醛（20梗塞面積（%）41.28±6.15 30.34±5.86 27.67±5.51△24.34±3.25△

3.2 原兒茶醛對大鼠MI／R 損傷血清中CK－MB，cTnI和LDH 的影響 與假手術(shù)比較，模型組血清CK－MB，cTnI和LDH 水平顯著升高（P ＜0.05）；原兒茶醛（20）組與模型組比較，血清CK－MB，cTnI和LDH 水平均顯著下降（P ＜0.05），詳見表2。

表2 原兒茶醛對大鼠MI／R 損傷血清CK－MB，cTnI和LDH 的影響（±s，n＝6）

表2 原兒茶醛對大鼠MI／R 損傷血清CK－MB，cTnI和LDH 的影響（±s，n＝6）

注：△P ＜0.05 vs 假手術(shù)組；▲P ＜0.05 vs 模型組。

組別CK－MB（ng／mL） cTnI（ng／mL）LDH（U／L）假手術(shù)組37.19±15.06 2.95±0.83 18450.50±524.16模型組92.03±12.38■ 12.39±2.30■51981.02±1341.67原兒茶醛（5）83.81±12.44 10.35±1.06 49419.67±764.63原兒茶醛（10）76.33±9.75 44.20±17.07▲33921.12±872.96▲原兒茶醛（20） 10.02±1.42▲7.38±1.20▲ 20872.29±717.21▲△

4 討 論 研究普遍認(rèn)為心肌缺血期間的損傷為再灌注損傷的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)，再灌注損傷是缺血損傷的延續(xù)、擴(kuò)大和惡化［9］。隨著心臟血流的重建，左心室功能得到改善，這部分心肌將得以保全。如能合理使用抗再灌注損傷藥物，將大大減少再灌注損傷帶來的危害［10］。

隨著氧自由基（OFR）在疾病中的研究日趨深入，大量資料證實氧自由基與MI／R 損傷的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系。較為一致的觀點認(rèn)為，由于種種致病因子的作用，導(dǎo)致OFR 蓄集，OFR 使細(xì)胞膜上的脂質(zhì)產(chǎn)生過氧化而生成過氧化脂質(zhì)（LPO），LPO 進(jìn)一步損傷心肌細(xì)胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及功能，而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［11－14］。大量研究表明原兒茶醛具有較好的清除氧自由基的活性［5］。本研究觀察了原兒茶醛治療MI／R 損傷的保護(hù)作用，為其開發(fā)成臨床用藥奠定了理論基礎(chǔ)。

梗塞面積被認(rèn)為是衡量MI／R 損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，而心肌保護(hù)正是以縮小梗塞面積為前提的，臨床上心肌梗塞面積的大小直接關(guān)系到患者的預(yù)后［15］。通過測量大鼠心臟梗塞面積，我們發(fā)現(xiàn)原兒茶醛能夠顯著降低心肌梗塞面積，提示原兒茶醛對再灌注時的心肌具有良好的保護(hù)作用。此外，心肌損傷特異性的酶也是臨床診斷心肌缺血／再灌注損傷的指標(biāo)。其中CK－MB，cTnI和LDH 為細(xì)胞內(nèi)重要的能量代謝酶，是急性心肌損傷的血清標(biāo)志物［16］。MI／R 損傷大鼠血清中的CK－MB，cTnI和LDH 含量均明顯升高；而原兒茶醛能夠降低大鼠血清中的CK－MB，cTnI和LDH 水平。通過以上藥效學(xué)指標(biāo)，我們證實原兒茶醛在MI／R 損傷中具有良好的心肌保護(hù)作用。

［1］ Peterson DA，Asinger RW，ElsPerger KJ，Homans DC，Eaton JW.Reactive oxygen sPecies may cause myocardial rePerfusion injury.Biochem BioPhys Res Commun［J］.1985，127（1）：87－93.

［2］ Venardos KM，Perkins A，Headrick J，Kaye DM.Myocardial ischemia－rePerfusion injury，antioxidant enzyme systems，and selenium：a review［J］.Curr Med Chem，2007，14（14）：1539－1549.

［3］ Zhou L，Zuo Z，Chow MS，et a1.Danshen：an overview of its chemistry，Pharmacology，Pharmacokinetics，and clinical use［J］.J Clin Pharmacol，2005，45（12）：1345－1359.

［4］ 付辛芳，劉曉紅.丹參的藥理作用與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國藥業(yè)，2006，15（1）：76－77.

［5］ 劉 梅，夏鑫華，張志敏，等.丹參素、原兒茶醛、咖啡酸和丹酚酸B體外抗氧化活性比較研究［J］.中藥材，2009，32（2）：265－267.

［6］ Hangaishi M，Nakajima H，Taguchi J，et a1.Lecithinized Cu，Zn－suPeroxide dismutase limits the infarct size following ischemia－rePerfusion injury in rat hearts in vivo［J］.Biochem BioPhy Res Commun，2001，285（5）：l220－1228.

［7］ Sodha NR，Clements RT，F(xiàn)eng J，et a1.The effects of theraPeutic sulfide on myocardial aPoPtosis in resPonse to ischemia－rePerfusion injury［J］.Eur J Cardiothorac Surg，2008，33（5）：906－913.

［8］ OsiPov RM，Bianchi C，F(xiàn)cng J，et a1.Effect of hy－Percholesterolenfia on myocardial necrosis and aPoPtosis in the setting of ischemia－rePerfusion［J］.Circulation，2009，120SuPPl l1：S22－S30.

［9］ 石燕燕；李樹青.心肌缺血再灌注損傷治療進(jìn)展［J］.中國心血管病研究雜志，2007，5（10）：777－779.

［10］ 田 濤，馬 賓.藥物后處理對減輕心肌缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展［J］.中華老年心腦血病雜志，2011，13（2）：181－183.

［11］ Lin Y H，Liu A H，Wu H L，et a1.Salvianolic acid B，an antioxidant from Salvia mihiorrhiza，Prevents Aβ25－35－induced reduction in BPRP in PC12cells［J］.Biochemical and Bio－Physical Research Communications，2006，348（2）：593－599.

［12］ Yue K K.M.，Lee K W，Chan K K C，et a1.Dansh－en Prevents the occurrence of oxidative stress in the eye and aorta of diabetic rats without affecting the hyPerglycemic state［J］.EthnoPharma，2006，106（1）：136－141.

［13］ Zhao G R，Xiang Z J，Ye T X，et a1.Antioxidant activities of Salvia miltiorrhiza and Panax notoginseng［J］.Food Chemistry，2006（4）：767－774.

［14］ Xia Z Y，Gu J Z，Ansley D M，et a1.Antioxidant theraPy with Salvia miltiorrhiza decreases Plasma endothelin－1 and thromboxane B2after cardioPulmonary byPass in Patients with congenital heart disease［J］.J Thoracic and Cardiovascular Surgery，2003，126（5）：1404－1410.

［15］ Friedrich，M.G.，Abdel－Aty，H.，Taylor，A.，Schulz－Menger，J.，Messroghli，D.and Dietz，R.，.The salvaged area at risk in rePerfused acute myocardial infarction as visualized by cardiovascular magnetic resonance［J］.J.Am.Coll.Cardiol，2008，51，1581－1587.

［16］ Gurgun C，Ildizli M，Yavuzgil O，Sin A，APaydin A，Cinar C and Kultursay H，.The effects of short term statin treatment on left ventricular function and inflammatory markers in Patients with chronic heart failure［J］.Int.J.Cardiol，2008，123：102－107.