HPLC檢測山茱萸中沒食子酸和馬錢苷的含量

楊 凌 朱 昱 王曉華 解放軍第202醫(yī)院藥劑科（沈陽110812）

山茱萸是山茱萸科植物山茱萸（Cornus of fcinalis Sieb.et Zucc.）的干燥成熟果肉，味酸、澀，性溫，歸肝、腎經(jīng)。具有斂汗、澀精和補肝腎的功能，臨床多用于治療腰膝酸痛、陽萎遺精、小便頻數(shù)、月經(jīng)過多、體虛多汗等癥［1］，是中醫(yī)常用的滋補良藥。據(jù)報道，山茱萸中的主要成分為多糖、酚類、有機酸、皂苷、環(huán)烯醚萜類、鞣質(zhì)、揮發(fā)油、氨基酸和維生素A、B、C及微量元素等［2］。研究表明，馬錢苷是山茱萸的主要活性成分之一，其主要藥理作用多為抗炎和調(diào)節(jié)免疫［3，4］；體外實驗證明，沒食子酸具有抑制淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的作用，濃度大于30μg／mL 可抑制98%，濃度大于15μg／mL可抑制70%［5］。常規(guī)研究多對單一成分進行分析，作為山茱萸藥材的質(zhì)量檢測，為了更好的分析山茱萸的質(zhì)量情況，本文采用波長切換HPLC 法同時檢測山茱萸中的主要有效成分－馬錢苷和沒食子酸，該方法準(zhǔn)確、高效、簡便，具有較好的推廣應(yīng)用價值。

1 儀器與試藥 Waters 600E 高效液相色譜儀（在線真空脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、Waters 2487VWD 檢測器）；Mettler AG285電子天平（0.01mg）；KQ－500E型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。山茱萸藥材經(jīng)鑒定為山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉。沒食子酸對照品購于中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司；馬錢苷對照品購于中國藥品生物制品檢定所。乙腈和甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果 2.1 供試品溶液的制備 稱取山茱萸粉末約1g，精密稱定，置圓底燒瓶中，量取25mL加入70%甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足丟失的質(zhì)量，即得。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱定馬錢苷和沒食子酸對照品2.26mg 和2.27 mg，分別置10 mL容量瓶中，加70%甲醇溶解并定容得混合對照品母液。再分別取該儲備液適量，用70%甲醇逐級稀釋成馬錢苷濃度為l14、57、28.5、14.3、7.2、3.6 mg／L，沒食子酸濃度為112、56.0、28.0、14.0、7.0、3.5mg／L的系列的混合對照品溶液，備用。

2.3 色譜條件 色譜柱：hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：A 為乙腈，B 為0.1%磷酸水溶液，采用梯度洗脫法洗脫，具體洗脫程序見表1，分析時間為28 min；檢測波長0－7 min：270nm，7.01～26min：240nm；柱溫30℃；流速1mL／min；進樣量10μL。理論塔板數(shù)按馬錢苷計不低于2500。色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

圖1 HPLC色譜圖

2.4 檢測波長的選擇 分別取沒食子酸對照品和馬錢苷適量，用流動相稀釋成10μg／mL，以流動相為空白，進行全波長掃描。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 精密吸取對照品混合液10μL進樣測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得沒食子酸回歸方程為A＝3E＋07C－9205.7，r＝0.9999，線性范圍3.5mg／L－112mg／L；馬錢苷回歸方程為A＝2E＋07C－6884.3，r＝0.9999，線性范圍3.6mg／L－114mg／L。

2.6 方法學(xué)考察 2.6.1精密度試驗：選取河南產(chǎn)地山茱萸，按“2.1供試品溶液的制備”項下制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，分別計算峰面積，結(jié)果得馬錢苷和沒食子酸的精密度RSD 分別為1.3%、0.7%。

2.6.2 重復(fù)性試驗：取河南產(chǎn)地山茱萸，按“2.1供試品溶液的制備”項下制備供試品溶液，平行制備5份，取10μL進樣測定。具體結(jié)果見表2。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6.3 穩(wěn)定性試驗：取河南產(chǎn)地山茱萸，按“2.1供試品溶液的制備”項下制備供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12h后進樣測定，結(jié)果計算得馬錢苷和沒食子酸峰面積的RSD 分別為2.04%、1.27%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 加樣回收率試驗：稱取山茱萸粉末1g，精密稱定5 份，加入濃度為228 mg／L 馬錢苷和226 mg／L沒食子酸的混合對照品溶液0.8mL，按“2.1供試品溶液的制備”項下制備供試品溶液并測定，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果

2.7 樣品含量測定 按2.1項下制備4批不同產(chǎn)地的山茱萸藥材，按上述色譜檢測條件檢測，結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地山茱萸中沒食子酸和馬錢苷的含量

3 討 論 3.1 提取條件的考察 本實驗分別選擇了甲醇、70%甲醇、40%甲醇和95%乙醇，作為提取溶劑，超聲30 min 比較提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以70%甲醇作提取溶劑，提取率較高。以70%甲醇為溶劑，考察提取時間和提取方法，分別超聲提取30、40、50min，加熱回流提取30、60、90min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取率較高，且以超聲40min為適。以70%甲醇為提取溶劑，提取方法采用超聲提取40 min，考察提取溶劑加入量，分別加入10、25、40mL，結(jié)果表明提取溶劑為25mL時，提取率較高。通過上述實驗，選擇70%甲醇，25mL，超聲40min為最佳提取條件。

3.2 色譜條件的考察 本實驗考察了等度洗脫和梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)等度洗脫分析時間長，分離效果差；同時考察了不同洗脫劑，確定以乙腈－0.1%磷酸為最佳洗脫溶劑。

3.3 總結(jié) 本實驗采用HPLC 與波長切換法結(jié)合，同時測定山茱萸中的沒食子酸和馬錢苷成分。實驗結(jié)果表明，本測試方法簡便，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可全方面考察山茱萸的質(zhì)量，為山茱萸的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供具體的實驗參考依據(jù)。同時，本文還測定了不同產(chǎn)地山茱萸中沒食子酸及馬錢苷的含量，發(fā)現(xiàn)北京山茱萸的沒食子酸及馬錢苷含量較高。不同產(chǎn)地的山茱萸質(zhì)量不盡相同，因此，在藥材選擇時應(yīng)將產(chǎn)地作為質(zhì)量控制的主要影響因素。

［1］ 肖培根.新編中藥志［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：22.

［2］ 楊劍芳，路福平，高文遠(yuǎn)，等.山茱萸的化學(xué)、藥理及開發(fā)應(yīng)用研究進展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2006，6（12）：127－130.

［3］ 趙武述，張玉琴，李 潔，等.山茱萸成分的免疫活性研究［J］.中草藥，1990，21（3）：17－20.

［4］ MARIA D CR.Structural Considerations on the Iridoids as Anti－inflammatory Agent［J］.Planta Med，1994，60：233－234.

［5］ 陳玉武，薛 智.制萸肉免疫活性成分的化學(xué)研究［J］中日友好醫(yī)院學(xué)報，1992：6（增刊）：231.