西藏小型豬毛乳頭細胞的分離與培養(yǎng)

羅 洋，杜 華，鞠 英，王 潔，龍朝欽，高 劍，劉海燕

毛乳頭細胞在毛囊的發(fā)育及周期性生長調(diào)控中起重要作用。要闡明毛乳頭細胞對調(diào)節(jié)毛囊生長和發(fā)育的機制，必須從毛乳頭細胞自身分泌的生物活性成分著手[1]。我們在建立人毛乳頭細胞體外培養(yǎng)模型基礎(chǔ)上，應用低傳代人毛乳頭細胞的培養(yǎng)上清制成條件培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)其在體外有明顯的生物學活性[2]，并將毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液制成凍干粉，初步應用于脫發(fā)患者的治療，發(fā)現(xiàn)其有確切的治療作用[3,4]。但人毛乳頭細胞來源有限，制約其進一步研究，擬用豬毛乳頭細胞替代人毛乳頭細胞，希望能研究出人毛乳頭細胞的替代細胞。本研究應用西藏小型豬毛乳頭細胞進行分離與培養(yǎng)，觀察其培養(yǎng)條件和細胞生物行為，為進一步分析和研究豬毛乳頭細胞生長活性蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基（低糖）、分離酶、Ⅳ型膠原酶（Sigma 公司），D-Hanks 液、Hanks 液、新生小牛血清（Hyclone 公司），Hepes（Boehringer Mannheim 公司），胰蛋白酶（華美生物工程公司）。完全培養(yǎng)基以DMEM 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，其主要成分的終濃度分別為：1 000 ml DMEM 液中含2.4 g Hepes，0.3 g L-谷氨酰胺，10 萬U /L 青霉素，10 萬U /L 鏈霉素，調(diào)整pH 值至7.3 左右，使用前加入小牛血清至濃度為15%。

1.1.2 組織來源 2 月齡西藏小型豬背部皮膚。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬毛乳頭細胞的分離 在西藏小型豬背部無菌條件下取一直徑5 cm 左右全層皮膚，在無菌環(huán)境中進行下列操作：①在超凈臺上將已處理好的豬皮在不銹鋼腎形彎盤中用75%乙醇漬泡20 min，75%乙醇棉球擦洗2 遍，然后以吸管用生理鹽水反復用力沖洗3 遍；②用組織剪剪去標本邊緣部分，將豬皮放在已消毒好的木板上，用手術(shù)刀分離筋膜層，眼科剪清理殘留的筋膜層；③用組織剪將處理干凈的標本剪成0.3 ～0.5 cm 寬，3 ～4 cm 長的皮條，再將皮條從真皮-皮下脂肪層交界處剪開；④將脂肪層組織置于直徑為5 cm 的平皿中，加入0.5%分離酶浸沒，將平皿放入已消毒好的不銹鋼飯盒中，4 ℃過夜；⑤次日再將平皿37 ℃熱消化30 min，以生理鹽水將組織漂洗2 次，用眼科鑷將組織內(nèi)殘留毛囊下段擠出；⑥用組織剪將脂肪組織剪成米粒樣大小，以0.2%Ⅳ型膠原酶于平皿中37 ℃消化4 h；⑦將尚未消化組織去除，向消化液中加入等量DMEM 后移入50 ml 離心管中離心，2 000 r/ min 離心10 min，傾去上清液，管底沉淀組織移入含DMEM 的平皿中清洗，將其中網(wǎng)絡的大量豬毛乳頭洗下，洗下液體再加入50 ml 離心管中離心，1 000 r/ min 離心5 min；⑧將清洗液移入10 ml 的離心管中500 r/ min 低速離心3 ～4 次，每次3 min，每次吸去上清液；⑨在10 ml 的離心管中以1 000 r/ min 離心5 min，去上清后加入含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基后接種。

1.2.2 豬毛乳頭細胞的培養(yǎng) 將豬毛乳頭每瓶80 ～100 個接種于50 ml 一次性培養(yǎng)瓶中，在37 ℃ 5%CO2飽和水氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待大部分豬毛乳頭貼壁后，更換培養(yǎng)基，細胞融合后可進行1∶3 傳代培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 豬毛乳頭細胞的分離

每次可獲得超過 1 000 枚毛乳頭，新分離的毛乳頭呈橢圓形或圓形。

2.2 豬毛乳頭細胞的培養(yǎng)

獲得豬毛乳頭后接種培養(yǎng)瓶做懸浮培養(yǎng)，接種后豬毛乳頭細胞從豬毛乳頭邊緣中長出（圖1a），逐步向四周呈放射狀生長（圖1b），此時豬毛乳頭逐漸失去其原來的形狀，形成成片的細胞生長致密區(qū)，最后散開的豬毛乳頭細胞開始逐漸融合，融合后細胞大致仍由呈放射狀排列的多個細胞團組成，中央?yún)^(qū)細胞出現(xiàn)多層化，并向上堆積形成凝集性生長（圖1c）。

2.3 豬毛乳頭細胞的傳代培養(yǎng)

經(jīng)胰酶消化并傳代的毛乳頭細胞，逐漸重新傾向凝集生長，隨著時間的增加，凝集生長現(xiàn)象逐漸明顯（圖2a）。但隨著豬毛乳頭細胞傳代次數(shù)增加，凝集性生長現(xiàn)象逐漸消失（圖2b），6 代以后的豬毛乳頭細胞基本不再出現(xiàn)凝集性生長現(xiàn)象（圖2c）。

3 討論

研究表明，位于毛囊基底部的特殊間質(zhì)成分——毛乳頭在毛囊的生長發(fā)育、周期調(diào)控及維持毛發(fā)生長中起主導作用。毛乳頭的功能障礙是導致毛囊周期失衡和休止期脫發(fā)的主要起始因素[5]。因此研究毛囊的生長發(fā)育、調(diào)控機制應不能脫離毛乳頭細胞的功能狀態(tài)，對這方面的研究已逐漸成為毛囊生長、發(fā)育及周期調(diào)控的熱點。目前對毛乳頭細胞的研究已發(fā)現(xiàn)一些活性蛋白及細胞因子對毛囊的生長有調(diào)節(jié)作用，培養(yǎng)的毛乳頭細胞最明顯的特性是細胞融合前易于形成多層化的細胞團，即所謂凝集性生長的特性[2]。在前期的研究中，我們證實了毛乳頭細胞在體外凝集性生長狀態(tài)下的生物學功能明顯強于非凝集性生長，有較強的誘導毛囊形成能力，而在非凝集性生長狀態(tài)這種特性則減弱甚至消失[2-4]。因此，毛乳頭的凝集性生長狀態(tài)可能與其調(diào)控毛囊生長功能有著緊密聯(lián)系。

圖1 原代培養(yǎng)豬毛乳頭細胞（4×10）

西藏小型豬來源于青藏高原、海拔2 500 ～4 300 m的農(nóng)區(qū)和半農(nóng)牧區(qū)，是惟一能夠適應高海拔氣候和以放牧為主的豬種，抗逆性好，封閉的地理環(huán)境使西藏小型豬保存了非常純正的品種資源。我們在已建立和改進的二步酶消化法基礎(chǔ)上，應用手術(shù)刀分離豬皮膚組織，1 h 內(nèi)即可分離一直徑5 cm 左右豬皮，相對于以往用眼科剪分離皮下筋膜層，大大減少了工作量，節(jié)省了分離時間。在用酶消化時，采用無菌不銹鋼盒封裝后才拿出超凈臺，可明顯克服此步被污染的可能性；Ⅳ型膠原酶于平皿中37 ℃消化4 h，可分離到大量高純度的毛乳頭；本實驗采用膠原酶對細胞的消化作用比較緩慢、溫和，對毛乳頭細胞的損傷和刺激不大，分離獲得的毛乳頭細胞體外培養(yǎng)生長迅速。

西藏小型豬毛乳頭細胞低傳代時細胞呈凝集性生長，6 代后呈非凝集性生長，這與人毛乳頭細胞生物學相似[2]，其低傳代培養(yǎng)上清可作為條件培養(yǎng)基進一步研究。西藏小型豬對人抗原性較弱，不易過敏，是目前研究毛囊較為理想的研究對象。

[1] Soma T, Fujiwara S, Shirakata Y, et al. Hair-inducing ability of human dermal papilla cells cultured under Wnt/β-catenin signalling activation [J]. Exp Dermatol, 2012, 21(4):307-309.

[2] 羅洋, 郝飛, 鐘白玉, 等. 條件培養(yǎng)基對高傳代人毛乳頭細胞生長的影響 [J]. 中華皮膚科雜志, 2004, 37(11):648-650.

[3] 羅洋, 杜華, 王潔, 等. 人毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液治療女性脫發(fā)的臨床療效觀察 [J]. 西北國防醫(yī)學雜志, 2011, 32(1):1-3.

[4] 羅洋, 郝飛, 杜華, 等. 人毛乳頭細胞條件培養(yǎng)液治療雄激素源性脫發(fā)的臨床觀察 [J]. 中國美容醫(yī)學, 2009, 18(7):980-982.

[5] Kawano M, Han J, Kchouk ME, et al. Hair growth regulation by the extract of aromatic plant Erica multiflora [J]. J Nat Med, 2009, 63(3):335-339.