六味地黃丸含藥血清減輕KCl誘導的PC12細胞損傷

王 俊，劉慧慧，陳文娜，柳 春

(遼寧中醫(yī)藥大學1.教務處;2.生理與心理教研室;3.實驗中心;4.生物化學教研室，遼寧沈陽 110847)

老年性癡呆是老年期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進行性慢性疾病，主要臨床表現(xiàn)為進行性的記憶能力減退，認知障礙，情感淡漠等。隨著我國逐步進入老齡化社會，其發(fā)病率也逐年升高?，F(xiàn)代醫(yī)學對于此病尚無很有效的防治措施。中醫(yī)認為老年性癡呆的發(fā)病與“腎虛”密切相關(guān)，認為“腎虛髓空”是老年癡呆發(fā)病的根本［1］。因此，“補腎”對于預防和治療老年性癡呆具有重要的意義。本研究選取滋陰補腎的經(jīng)典名方“六味地黃丸”含藥血清，對KCl誘導的損傷細胞進行干預，觀察對其乳酸脫氫酶活力的影響，并檢測細胞環(huán)磷酸腺苷反應元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)的基因及蛋白表達水平，以探討六味地黃丸對神經(jīng)細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:SPF級雄性SD大鼠22只，體質(zhì)量(300～350 g)，［北京華阜康生物科技股份有限公司，SCXK(京)2009-0004］，隨機分為正常組與六味地黃丸干預組。

1.1.2 藥品與試劑:六味地黃丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠);MTT(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司);乳酸脫氫酶測試盒(南京建成生物工程研究所);RT-PCR試 劑 盒、CREB引 物、β-actin引 物和Trizol試劑盒［寶生物工程(大連)有限公司］，兔抗大鼠CREB抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 含藥血清的制備

六味地黃丸干預組，以生藥濃度為0.75 kg/L水溶液［2］，按10 mL水溶液/kg灌胃，每天 2次，正常組給予同體積雙蒸水灌胃，連續(xù)給藥4 d，第5天首次給藥1.5 h后腹主動脈取血，靜置2 h，2 000 r/min離心10 min后分離血清。經(jīng)56℃，30 min滅活，0.22 μm濾膜過濾滅菌，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細胞培養(yǎng)、分組及處理

取對數(shù)生長期的PC12細胞(中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所)，濃度為1×105個/mL，培養(yǎng)12 h后，換用無血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h后用于實驗。細胞分為1)對照組(control):10%正常血清;2)模型組(model):10%正常血清;3)六味地黃丸含藥血清組(LW-containing serum，LWCS):10%六味地黃丸含藥血清(預保護48 h)。2、3 組經(jīng)150 mmol/L KCl刺激20 min后，用PBS洗2遍后加入無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.4 指標檢測與方法

1.4.1 MTT法測定細胞存活率:不同濃度的KCl及不同作用時間對PC12細胞活力的影響:配置濃度為50、100、150 和200 mmol/L的 KCl，分別損傷10、20 和30 min。按文獻［3］方法酶標儀(492 nm)檢測。

1.4.2 LDH活性測定:收集細胞上清液，每組測定5個復孔，毎孔20 μL上清液，按照說明書測定450 nm的A值。

1.4.3 RT-PCR法檢測細胞CREB mRNA表達:利用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物(TaKaRa公司)。CREB1引物序列，上游引物:5'-CTGATTCC CAAAAACGAAGG-3'，下游引物:5'-CTGCCCACTG CTAGTTTGGT-3'，擴增產(chǎn)物長度為188 bp;β-actin引物序列，上游引物:5'-AGTGCGACGTGGACATCCG-3'，下游引物:5'-TGGCTCTAACAGTCCGCCTAG-3'，擴增產(chǎn)物長度為295 bp。反應條件:94℃，2 min;94℃，30 s;65℃，30 s;72℃，1 min;72℃，5 min;4℃保存。其中，從94℃，30 s到72℃，1 min為35個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，所得條帶使用WD-9413B凝膠成像分析儀進行圖像分析。用CREB與β-actin的mRNA的吸光度的比值(%)來表達CREB mRNA的相對表達量。

1.4.4 SABC法檢測細胞CREB的蛋白表達:細胞爬片，經(jīng)固定后，1∶100兔抗CREB抗體4℃過夜(陰性用PBS代替)，滴加HRP二抗37℃孵育20 min，行常規(guī)免疫組化染色。應用BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，測定每個視野下的陽性細胞表達的平均吸光度(mean absorbance，MA)值。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡下，對照組細胞為梭形，細胞間接觸緊密，偽足有交錯，增值旺盛，折光度強;模型組細胞偽足消失，大部分折光度減弱，部分細胞皺縮、變圓、脫落，漂浮于培養(yǎng)基中;六味地黃丸含藥血清組細胞折光度強，細胞增殖旺盛(圖1)。

2.2 KCl誘導細胞損傷模型建立

隨著KCl的濃度加大及作用時間延長，細胞活力逐漸減弱(表1)。

2.3 各組細胞LDH活力、CREB的基因及蛋白表達變化

圖1 KCl作用各組細胞后形態(tài)變化Fig 1 The morphology of cells in each group(×200)

表1 不同濃度的KCl及作用不同時間對PC12細胞活力的影響Table 1 Activity of PC12 cells induced by KCl in different cencentration and different time(±s，A value，n=5)

表1 不同濃度的KCl及作用不同時間對PC12細胞活力的影響Table 1 Activity of PC12 cells induced by KCl in different cencentration and different time(±s，A value，n=5)

＊P＜0.05 compared with control group.

KCl(mmol/L)10 min 20 min 30 min control 0.3990±0.1133 0.3990±0.1133 0.3990±0.1133 50 0.4005+0.2528 0.3719±0.0135 0.3367±0.0330 100 0.3527+0.5404 0.3409±0.0375 0.2731±0.0347*150 0.3045+0.3860 0.2873±0.0463*0.2447±0.0301*200 0.2857+0.3001 0.2747±0.0175*0.1885±0.0591*

2.3.1 KCl損傷對各組細胞LDH活力的影響:模型組細胞上清液中LDH活力顯著增高于對照組(P＜0.01)，六味地黃丸含藥血清組細胞上清液中LDH活力較模型組顯著降低(P＜0.01)(表2)。

2.3.2 各組細胞CREB與β-actin的mRNA的吸光度比值(%)變化:模型組細胞的CREB mRNA相對表達顯著低于對照組(P＜0.01);六味地黃丸含藥血清組細胞CREB mRNA表達較模型組顯著回升(P＜0.01)(表2，圖2)。

2.3.3 各組細胞CREB蛋白表達的變化:模型組細胞的CREB蛋白表達顯著低于對照組(P＜0.01);六味地黃丸含藥血清組細胞CREB蛋白表達較模型組顯著回升(P＜0.01)(表2，圖3)。

3 討論

隨著年齡的增長，進入老年期，神經(jīng)元Ca2+調(diào)節(jié)功能出現(xiàn)紊亂，細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，Ca2+內(nèi)流增加、線粒體緩沖Ca2+的能力下降等［4］。細胞內(nèi)Ca2+濃度的持續(xù)升高會導致神經(jīng)元損傷和凋亡。超出細胞生長所需的正常濃度的K+可引起細胞膜電位去極化，膜上電壓門控鈣通道開放［5］，造成細胞內(nèi)鈣超載，本實驗結(jié)果表明不同濃度的KCl對細胞的損傷程度呈劑量-時間依賴性。通過MTT實驗結(jié)果篩選最終選取150 mmol/L KCl作為細胞損傷濃度，模擬神經(jīng)細胞損傷的狀態(tài)。

表2 各組細胞LDH活力、CREB的基因及蛋白表達變化Table 2 The protein levels of CREB，LDH and the expression of CREB mRNA in each group(±s)

表2 各組細胞LDH活力、CREB的基因及蛋白表達變化Table 2 The protein levels of CREB，LDH and the expression of CREB mRNA in each group(±s)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.01 compared with model group.

group LDH CREB mRNA CREB protein control 722±102 79.50±7.85 0.369±0.021 model 1452±33* 41.99±3.28* 0.282±0.023*LWCS 682±97# 69.20±3.19# 0.345±0.024#

圖2 各組細胞CREB及β-actin的mRNA RT-PCR結(jié)果Fig 2 The bands of CREB mRNA by RT-PCR in each group

圖3 各組細胞CREB免疫組化染色變化Fig 3 The immunohistochemistry stain of CREB in each group(×200)

CREB是真核細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［6］，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成，因此細胞內(nèi)CREB表達水平的高低可反映細胞的狀態(tài)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，CREB作為細胞內(nèi)多種信號傳導通路的重要作用點，通過Ca2+和cAMP等多種信號途徑被激活，進而調(diào)節(jié)下游相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄，從而影響神經(jīng)元的存活與生長、突觸的可塑性和學習記憶的形成［7］。因此當PC12細胞內(nèi)鈣超載后，細胞內(nèi)Ca2+信號通路被抑制，細胞內(nèi)CREB無法被激活，從而影響細胞存活。

中醫(yī)從“補腎填精”論治老年癡呆有效，已有實驗表明六味地黃丸對腎虛型老年癡呆癥狀具有明顯改善作用［8］。現(xiàn)代研究表明六味地黃丸可能通過作用于電壓門控離子通道，減小細胞興奮性時Ca2+由此時入胞內(nèi)的數(shù)量，調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度及胞內(nèi)級聯(lián)反應［9］。本實驗結(jié)果表明，六味地黃丸含藥血清對PC12細胞的影響明顯，為六味地黃丸臨床應用防治老年癡呆提供了實驗依據(jù)。但究竟是六味地黃丸中哪些成分發(fā)揮作用，或是六味地黃丸是否還通過其他途徑影響細胞，有待于進一步研究。

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