馬兜鈴酸通過ERK1/2信號傳導途徑誘導人臍靜脈血管內皮細胞凋亡

石 紅，馮江敏

(1.撫順市第二醫(yī)院腎內科，遼寧撫順113001;2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內科，遼寧沈陽 110001)

馬兜鈴酸腎病(aristolochic acid nephropathy，AAN)是一種由于服用含有馬兜鈴酸(aristolochic acid，AA)成分的藥物所致的腎小管間質疾病［1］。近年來，有關AA致腎間質微血管(peritubular capillaries，PTCs)病變造成小管間質缺血缺氧，腎間質纖維化的報告日益增加［2－4］。本研究體外實驗發(fā)現(xiàn)，AA可誘導血管內皮細胞凋亡。內皮細胞凋亡作為內皮損傷的主要形式，在血管病變的發(fā)生﹑發(fā)展過程中起著關鍵作用。胞外信號調節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)信號傳導途徑受到抑制是多種細胞凋亡的一個重要原因。研究表明，在內皮細胞中 ERK1/2能使BCL-2第87位的絲氨酸磷酸化，抑制其降解，而發(fā)揮其抗內皮細胞凋亡作用。為此，我們以體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)作為研究對象，探討AA是否通過抑制ERK1/2信號傳導途徑誘導血管內皮細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 細胞系及試劑

HUVECs系(ACTT提供，產(chǎn)品型號:CRL-1730)。馬兜鈴酸鈉鹽和 MTT(Sigma公司)，Hoechst 33258試劑盒和兔抗人p-ERK1/2多克隆抗體(碧云天生物公司)，AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒(晶美生物公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組:HUVECs細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，其中含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 U/mL)。細胞于37℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)。3～5代細胞用于實驗。AA組:AA的終濃度分別為5、10和20 mg/L;另設正常對照組:加入不含AA的DMEM培養(yǎng)液;PD98095預處理組:內皮細胞先經(jīng)ERK1/2抑制劑PD98095(20 μmol/L) 預 處理30 min，再 以10 mg/L AA處理。各組細胞培養(yǎng)24 h后，進行檢測。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖能力:將HUVECs細胞按1×104/mL接種于 96孔培養(yǎng)板，每孔體積100 μL。培養(yǎng)24 h后，以 5、10 和20 mg/L濃度 AA分別作用 12、24和48 h后，每孔加入 MTT溶液(5 g/L)20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h。吸棄孔內培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在全自動酶標儀中選擇490 nm波長測各孔吸光度值(A值)。

1.2.3 hoechst 33258熒光染色觀察細胞形態(tài)學改變:將細胞按實驗分組處理后，吸棄各孔中上清，PBS洗2次，加入4%多聚甲醛溶液0.5 mL，4℃固定10 min，棄去固定液，PBS洗2次，再加入Hoeehst 33258熒光染液0.5 mL，室溫孵育10 min，PBS洗2～3次，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率:收集各組細胞，PBS緩沖液洗2次。加入100 μL結合緩沖液重懸細胞，加入 AnnexinⅤ-FITC 5 μL和 PI染液10 μL，孵育15 min，再加入400 μL結合緩沖液，輕輕混勻，上流式細胞儀，檢測細胞凋亡率。

1.2.5 Western blot檢測細胞p-ERK1/2蛋白的表達:用 RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白。取100 μg樣品，進行SDS-PAGE凝膠電泳。將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，然后以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗 p-ERK1/2(1∶500)，4 ℃孵育過夜，次日加入HRP標記的二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，加入ECL顯色液進行顯色，曝光。用Scion Image分析軟件對目的條帶進行灰度值分析。以目的蛋白的吸光度值與β-actin的吸光度值之比表示目的蛋白的相對量。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，各組間數(shù)據(jù)的比較采用方差分析。

2 結果

2.1 AA對內皮細胞增殖的影響

AA濃度為5、10和20 mg/L分別作用12、24和48 h時，與正常對照組相比，AA呈濃度和時間依賴方式明顯抑制了內皮細胞的增殖(P＜0.05，P＜0.01)(圖1)。

2.2 AA對內皮細胞形態(tài)學改變的影響

正常細胞染色質均勻，發(fā)出均勻藍色熒光。細胞發(fā)生凋亡時，染色質固縮，胞核致密深染，或呈碎塊狀，染色質邊集，胞內可見亮藍色強熒光。正常對照組少見凋亡細胞。伴隨AA濃度的增加，凋亡細胞逐漸增加(圖2)。

2.3 AA對內皮細胞凋亡率的影響

AA濃度為5、10和20 mg/L時，細胞凋亡率為11.79% ±1.29%、27.79% ±2.56%和32.33% ±3.82%，均分別顯著高于對照組的6.64% ±0.78%(P＜0.05，P＜0.01)(圖3)。

2.4 AA對內皮細胞p-ERK1/2水平的影響

圖1 AA對內皮細胞增殖的影響Fig 1 Effect of AA on the viability of HUVECs(n=8)

正常對照組有基礎量p-ERK1/2表達。與正常對照組相比，10 mg/L AA能明顯抑制細胞內ERK1/2的磷酸化(P＜0.01)。經(jīng)ERK1/2抑制劑PD98095預處理30 min后，能顯著削弱AA對細胞內ERK1/2磷酸化的抑制作用(P＜0.01)(圖4)。

2.5 PD98095對AA引起的內皮細胞凋亡率的影響

與正常對照組相比，AA(10 mg/L)顯著增加了內皮細胞的凋亡率(P＜0.01)。給予PD98095預處理后，內皮細胞的凋亡率相對AA(10 mg/L)組顯著降低(P＜0.05)(圖5)。

3 結論

近年來，由含AA成分的中草藥引起的腎臟損害受到國內外學者們的廣泛關注，并進行了許多相關研究。近年研究發(fā)現(xiàn)，PTCs病變在AAN發(fā)生發(fā)展起重要地位。內皮細胞損傷是微血管病變發(fā)生發(fā)展的始動環(huán)節(jié)。然而內皮細胞的過度凋亡卻是內皮細胞功能失調的始動環(huán)節(jié)［5］。內皮細胞凋亡可削弱細胞間連接，破壞血管內皮層致密結構，引起血管屏障功能障礙;內皮細胞凋亡可促進單核/巨噬細胞向內皮下遷移，使血管平滑肌細胞直接暴露于各種炎性刺激因子的環(huán)境中，刺激血管平滑肌細胞增殖及內膜下遷移;凋亡的血管內皮細胞可改變血管內皮的抗凝特性，使血管內皮進入促凝狀態(tài)，從而誘發(fā)了血管病變的發(fā)生。

圖2 AA對內皮細胞形態(tài)學改變的影響(×400)Fig 2 Effect of AA on the morphological changes of HUVECs(×400)

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，血管內皮細胞經(jīng)不同濃度AA處理24 h后，隨著AA濃度增加，呈亮藍色強熒光的凋亡細胞也隨之增加，說明AA可誘導血管內皮細胞發(fā)生凋亡。本實驗進一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度AA分別作用于血管內皮細胞24 h后，內皮細胞凋亡率呈濃度依賴方式增加，進一步說明AA可誘導血管內皮細胞發(fā)生凋亡。

圖5 PD98095對AA引起的內皮細胞凋亡率的影響Fig 5 Effect of PD98095 on the apoptotic percentage of HUVECs induced by AA(n=3)

ERK1/2激酶與BCL-2家族蛋白有著密切關系，ERK1/2的激活不但可以上調BCL-2等抗凋亡蛋白的表達，而且可以導致其活化［6－7］。已證實許多凋亡誘導因子通過抑制MAPK途徑中ERK1/2的磷酸化而增加BCL-2降解，促使凋亡的發(fā)生。本實驗亦顯示，AA能明顯抑制p-ERK1/2的表達。然而，ERK1/2抑制劑(PD98095)預處理后，將導致AA抑制的內皮細胞p-ERK1/2的表達顯著減弱，并且，可使AA引起的內皮細胞凋亡率增加明顯減弱，這提示AA引起的血管內皮細胞凋亡可能是通過抑制ERK1/2信號傳導途徑實現(xiàn)。

綜上所述，AA通過抑制ERK1/2信號傳導途徑誘導血管內皮細胞凋亡，其可能在腎間質微血管病變發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。

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