氧化型α1抗胰蛋白酶定量檢測(cè)試劑盒研制及對(duì)吸煙男性的檢測(cè)分析

李振軍，樊一筍，Alam Sam，陳 菲

(上海交通大學(xué)附屬蘇州九龍醫(yī)院1.特需醫(yī)療科;2.檢驗(yàn)科，江蘇蘇州215021;3.劍橋大學(xué)醫(yī)學(xué)系，劍橋，CB2 0QQ英國(guó);4.蘇州和銳醫(yī)藥科技有限公司，江蘇蘇州2 15123)

α1 抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，α1-AT)是一種在肺組織高表達(dá)的蛋白酶抑制劑，它的主要功能是抑制肺組織中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)的活性，保護(hù)肺組織不受蛋白酶的損傷。研究表明，慢性阻塞性肺氣腫(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的發(fā)生與吸煙等氧化應(yīng)激導(dǎo)致 α1-AT被氧化成氧化型 α1-AT(Ox-AT)有關(guān)［1－3］。由于缺乏有效的 Ox-AT定量檢測(cè)方法，Ox-AT與我國(guó)COPD的相關(guān)性研究未見報(bào)道，本研究用Ox-AT特異性單克隆抗體構(gòu)建Ox-AT的定量檢測(cè)方法，并分析我國(guó)吸煙男性血清Ox-AT的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

Ox-AT制備方法見參考文獻(xiàn)［3］，用N-氯代琥珀酰亞胺與α1-AT(Sigma公司)共孵育純化后獲得，抗Ox-AT單克隆抗體制備見［4］，該單抗不識(shí)別天然α1-AT(N-AT)及與NE結(jié)合的α1-AT。兔抗人α1-AT多抗(Sigma公司)和酶標(biāo)羊抗人 α1-AT(Abcam公司)識(shí)別所有構(gòu)型的α1-AT。

1.2 Ox-AT單抗及市售抗體的特異性吸附實(shí)驗(yàn)

用0.5 mg/L濃度Ox-AT或α1-AT包被酶標(biāo)板并封閉，分別用兔抗人α1-AT多克隆抗體、酶標(biāo)羊抗人α1-AT和鼠抗人Ox-AT單抗孵育1 h，洗滌拍干后用對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)二抗孵育1 h，洗滌拍干，加TMB反應(yīng)底物孵育20 min，加終止液后450 nm酶標(biāo)儀讀數(shù)，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以平均吸光度(A)值作表。

1.3 Ox-AT雙抗夾心ELISA法

用pH 8.0碳酸鹽緩沖液稀釋兔抗人α1-AT多克隆抗體(1∶1 000)，每孔100 μL加入微孔板，4 ℃過夜;用含1 g/L蔗糖和0.5%牛血清白蛋白(BSA)的碳酸鹽緩沖液(pH 8.0)4℃封閉過夜，洗滌3遍后烘干備用。

抗體工作濃度確定:用抗體稀釋液稀釋Ox-AT單抗和酶標(biāo)羊抗鼠單抗，棋盤法確定兩種抗體的工作濃度。

1.4 試劑盒性能檢測(cè)

線性范圍:用樣品稀釋液稀釋Ox-AT共10個(gè)濃度:1 000、500、250、100、25、10、5、1、0.1 μg/L和0，每濃度3個(gè)復(fù)孔。計(jì)算各濃度的平均值，將平均值和稀釋比例用最小二乘法進(jìn)行直線擬合，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)R2。根據(jù)通用標(biāo)準(zhǔn)，試劑盒的R2值應(yīng)不小于0.990 0。

檢測(cè)限:用樣本稀釋液作為樣本進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定20次，得出20次測(cè)量結(jié)果的A值，計(jì)算其平均值(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)，得出x±2s所對(duì)應(yīng)的A值，根據(jù)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出此A值所對(duì)應(yīng)的濃度值即為檢測(cè)限。

準(zhǔn)確度:將已經(jīng)確定為250 μg/L的Ox-AT溶液作為參考品，用樣品稀釋液稀釋10倍，重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算平均值，根據(jù)公式CV=(x－理論值)/理論值×100%。

重復(fù)性:用5和25 μg/L兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測(cè)10次，計(jì)算10次A值的平均值x和標(biāo)準(zhǔn)差s，根據(jù)公式CV=s/x×100%計(jì)算得出變異系數(shù)CV。

批間差:用3個(gè)不同批的試劑盒分別檢測(cè)同一份樣本，各重復(fù)10次，計(jì)算30次測(cè)量結(jié)果的平均值x和標(biāo)準(zhǔn)差s，根據(jù)公式CV=s/x×100%得出變異系數(shù)CV。

穩(wěn)定性:采用37℃加速老化實(shí)驗(yàn)，將試劑盒放置4℃和37℃，每24 h進(jìn)行一次檢測(cè)，測(cè)定陰性對(duì)照(樣品稀釋液)和陽性對(duì)照(250 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品)的A值，當(dāng)陽性對(duì)照37℃試劑與4℃陽性對(duì)照的比值小于0.7時(shí)［5］，判斷試劑盒失效。

1.5 血清Ox-AT和α1-AT定量檢測(cè)

取1.2法包被封閉的酶標(biāo)板，血清用樣品稀釋液1∶2稀釋，稀釋后的吸煙者血清和對(duì)照血清100 μL加入酶標(biāo)板微孔中，Ox-AT標(biāo)準(zhǔn)品6個(gè)濃度梯度加入微孔中，37℃孵育1 h，洗板5次;Ox-AT單抗1∶500稀釋，每孔100 μL加入微孔中37 ℃ 孵育1 h，洗板 5次;酶標(biāo)羊抗鼠 IgG 1∶5 000稀釋，每孔100 μL加入微孔中37℃孵育1 h，洗板5次;加TMB顯色液孵育20 min;加終止液10 min后450 nm酶標(biāo)儀(imark，bio-rad)讀數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算樣品中Ox-AT含量。

檢測(cè)α1-AT的酶標(biāo)板與檢測(cè)Ox-AT的一樣，也用α1-AT兔抗包被，所不同的是用酶標(biāo)羊抗人α1-AT抗體，根據(jù)N-AT標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算樣品中α1-AT含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 鼠抗人Ox-AT不吸附N-AT包被板

鼠抗人Ox-AT單抗只對(duì)Ox-AT包被板有吸附作用，對(duì)N-AT包被板沒有吸附作用。但兔抗人α1-AT多抗和酶標(biāo)羊抗人α1-AT除了對(duì)N-AT包被板有良好的吸附作用之外，對(duì)Ox-AT也有吸附作用，而且對(duì)兩種包被板的吸附作用程度無顯著差異(表1)。

表1 Ox-AT及N-AT包被板與各種抗體的吸附作用Table 1 Absorption of Ox-AT and N-AT coated plates with different antibodies

2.2 試劑盒組裝

經(jīng)過方陣法確定，一抗稀釋倍數(shù)為1∶500，孵育時(shí)間1 h;酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)1∶5 000，孵育時(shí)間1 h;TMB底物顯色時(shí)間20 min;Ox-AT標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、5、10、50、100 和500 μg/L。

2.3 試劑盒性能指標(biāo)

2.3.1 線性范圍:以0～1 000 μg/L Ox-AT標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不同濃度所測(cè)得的A值(表2)作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，R2值為0.852 9，當(dāng)剔除最高濃度1 000 μg/L時(shí)，R2值為0.995 5(圖1)，線性范圍為0～500 μg/L。

2.3.2 檢測(cè)限:重復(fù)檢測(cè)20次的檢測(cè)值為0.041±0.015(表3)，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2，R2=0.9977，檢測(cè)限為x±2s即0.071，對(duì)應(yīng)濃度是2.85 μg/L。

2.3.3 準(zhǔn)確度:250 μg/L Ox-AT稀釋10倍重復(fù)3次的檢測(cè)值為27.95 μg/L，變異系數(shù)CV=(x－理論值)/理論值×100%=11.81%，準(zhǔn)確度為88.19%。2.3.4 批間差:3個(gè)批次試劑盒檢測(cè)同一份血清樣本10 次的均值分別為 105.56、116.45 和115.87 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)差 為 12.68 μg/L，計(jì) 算 CV=s/x×100% =11.26%。

表2 Ox-AT所對(duì)應(yīng)的A值Table 2 A value corresponding to different concentration of Ox-AT

圖1 Ox-AT ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Standard curve of Ox-AT ELISA

表3 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品稀釋液重復(fù)20次的A值Table 3 A value of standard and sample diluents which were repeated 20 times(±s，n=3)

表3 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品稀釋液重復(fù)20次的A值Table 3 A value of standard and sample diluents which were repeated 20 times(±s，n=3)

Ox-AT(μg/L) Avalue 0 0.062±0.018 5 0.084±0.022 10 0.093±0.023 50 0.216±0.049 100 0.276±0.068 500 1.246±0.092 0 0.041±0.015(n=20)

2.3.5 重復(fù)性:25 μg/L重復(fù)檢測(cè)10次的檢測(cè)值為0.122±0.013，CV 為10.57%。100 μg/L重復(fù)檢測(cè)10次的檢測(cè)值為0.305±0.026，CV為8.58%。

圖2 檢測(cè)限檢測(cè)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 Standard curve of LOD

2.3.6 穩(wěn)定性:4℃放置10 d陽性和陰性對(duì)照組無顯著變化，37℃放置6 d后陽性對(duì)照組的A值開始下降(圖3)，但比值為 0.97＞0.7，第 8天比值0.65＜0.7，試劑盒失效。按37℃ 1 d等于4℃ 1個(gè)月推算，試劑盒的保質(zhì)期超過6個(gè)月。

2.4 吸煙與非吸煙者血清Ox-AT和α1-AT的含量

吸煙組血清Ox-AT的含量為55.43±49.94 μg/L，顯著高于非吸煙組的11.01±12.15 μg/L(P＜0.001)。

圖3 試劑盒穩(wěn)定性試驗(yàn)Fig 3 Stablity test

吸煙組的血清α1-AT為1 922±754 mg/L，與非吸煙組的1 665±626 mg/L，無明顯差別。

3 討論

α1-AT是人類血漿中最豐富的蛋白酶抑制子，血中濃度高達(dá) 1.5～3.5g/L［4］。國(guó)外研究表明，體內(nèi)α1-AT濃度相對(duì)不足和吸煙是COPD的兩大重要病因，先天性α1-AT缺乏癥患者在早年即發(fā)生嚴(yán)重的COPD［1］。但多數(shù)國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)并不支持α1-AT與我國(guó) COPD的相關(guān)性［6－9］。本實(shí)驗(yàn)前期給轉(zhuǎn)染人α1-AT小鼠吸煙，闡明了吸煙不但顯著誘導(dǎo)α1-AT突變型(歐美常見基因型)而且也誘導(dǎo)野生型(國(guó)人常見基因型)小鼠產(chǎn)生 Ox-AT［3］，用 Ox-AT作用體外培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞，能使細(xì)胞釋放炎性因子IL-8和MCP-1［3］，這些結(jié)果提示Ox-AT可能與我國(guó)COPD具有相關(guān)性。

本研究針對(duì)現(xiàn)有α1-AT檢測(cè)方法不能區(qū)分NAT和Ox-AT這一現(xiàn)狀，用一種Ox-AT特異性單抗與市售α1-AT多抗研制成Ox-AT雙抗夾心ELISA檢測(cè)試劑盒。經(jīng)檢測(cè)，該試劑盒的各項(xiàng)性能基本符合診斷試劑盒的基本性能要求。由于時(shí)間有限，本實(shí)驗(yàn)未能檢測(cè)試劑盒的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，用37℃加速老化實(shí)驗(yàn)推算試劑盒在4℃至少6個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定性，符合試劑盒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

用本研究方法研制的Ox-AT定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了20對(duì)吸煙與非吸煙男性血清中Ox-AT的表達(dá)量，吸煙組Ox-AT顯著高于非吸煙組，然而，吸煙組與非吸煙組的血清α1-AT無顯著差異，這一結(jié)果提示，Ox-AT可能比α1-AT更適合作為COPD的評(píng)價(jià)指標(biāo)。由于本研究樣本量有限，后續(xù)有必要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果。

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