免疫- PCR檢測技術(shù)及其應(yīng)用

劉 京，許 楊，王 丹，鄒 龍

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，中德聯(lián)合研究院，江西南昌 330047)

隨著科學(xué)技術(shù)水平的發(fā)展，人類對分析精度的要求也日益增高，痕量檢測已成為生命科學(xué)和環(huán)境分析的熱點問題。1991年Sano［1］等首次將PCR技術(shù)引入免疫反應(yīng)，把抗原抗體反應(yīng)的強特異性與PCR技術(shù)的高敏感性、強擴增能力結(jié)合在一起，開發(fā)了免疫－PCR技術(shù)(immuno polymerase chain reaction，IPCR)。免疫－PCR憑借PCR的龐大的擴增能力和特異性，比現(xiàn)有的多種形式的免疫檢測方法都靈敏，能夠?qū)z測的靈敏度提高幾個數(shù)量級，理論上可以檢測到一個抗原分子。免疫－PCR盡管具有非常高的靈敏度，但其要求掌握ELISA和PCR技術(shù)且試劑的稀缺，很長一段時間對它的研究都受到限制，應(yīng)用也處于探索階段。近年來，新型連接分子的出現(xiàn)，即用型試劑的使用及與其它技術(shù)(如納米技術(shù))的結(jié)合使得免疫PCR成為診斷檢測的選擇之一。目前，已應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等各個領(lǐng)域。

1 IPCR的原理及類型

1.1 IPCR的原理

IPCR的基本原理與 ELISA(enzyme－linked immuno sorbent assay，酶聯(lián)免疫吸附實驗)基本相似，不同的是將一段可擴增的DNA分子代替ELISA中的酶促反應(yīng)信號［2］。具體步驟如下［3－4］:選擇具有分別針對標記物和抗體的雙特異性連接分子M;選擇能夠與抗原－抗體復(fù)合物特異性連接的標記物，通常是典型的DNA、RNA、DNA－RNA復(fù)合物以及它們的衍生物、片段或類似物，這類標記物可進行PCR擴增;PCR的擴增產(chǎn)物通過現(xiàn)有的方法檢測，如通過瓊脂糖凝膠電泳、熒光定量PCR來進行分析等，原理圖如圖1所示。

圖1 免疫－PCR的原理［3］Fig.1 The principle of immuno polymerase chain reaction［3］

1.1.1 標記物分子與抗體的連接 免疫－PCR需要適當?shù)姆椒▽擞浄肿优c抗體連接起來。目前，常見的方法有以下兩類:a.使用連接蛋白(傳統(tǒng)方法)，常用的為鏈親和素－生物素系統(tǒng)及親和素－生物素系統(tǒng)。生物素能與IgG的Fc端連接，同時也能標記雙鏈DNA，因此以鏈親和素(或親和素)為橋梁，可以將抗體與 DNA連接。該法需要多個步驟，較為費時［5－6］。b.使 用 化 學(xué) 試 劑，常 用 的 有 SMCC(succinimidyl－4－(N－maleimidomethyl)cyclohexane－1－carboxylate，4－(N－馬來酰亞胺甲基)環(huán)已烷－1－羧酸琥珀酰亞胺酯)和sulfo－SMCC。該方法步驟簡單，反應(yīng)時間短，減少了發(fā)生在孵育階段的不完全結(jié)合或非特異結(jié)合，靈敏性超過了傳統(tǒng)方法［7－9］。

表1 不同類型的IPCRTable1 The different types of IPCR

1.1.2 標記物的選擇 理論上，任何DNA、RNA或DNA－RNA復(fù)合物都可以作為免疫－PCR系統(tǒng)的標記物，但標記物需有較高的純度及較好的擴增效果，與PCR系統(tǒng)存在的其他DNA分子不具同源性，以避免DNA污染造成的非特異性擴增。最早Sano等使用的是pUC19質(zhì)粒，而后又出現(xiàn)了pUC18、舌蘭病毒、pGL2 等。2006 年，Guo［10］等提出了噬菌體為標記物的新型IPCR技術(shù)，展示在噬菌體表面的單鏈抗體可替代傳統(tǒng)IPCR中的單克隆抗體，噬菌體的DNA可作為IPCR中的標記物，該設(shè)計克服了單鏈抗體低檢測靈敏度的缺陷，操作簡單，耗費低，靈敏度高。

1.1.3 檢測方法

1.1.3.1 電泳法 常用瓊脂糖凝膠電泳，取PCR產(chǎn)物進行溴化乙淀染色，在瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)反轉(zhuǎn)成像。宋云揚［11］等用夾心免疫－PCR檢測金葡菌腸毒素B時，采用瓊脂糖凝膠電泳分析，其方法是將PCR產(chǎn)物用溴化乙淀染色，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，而后通過凝膠成像系統(tǒng)成像，檢測靈敏度達0.1ng/L，而普通ELISA檢測靈敏度為1μg/mL。該法操作簡單，耗費低，但靈敏度較其它檢測方法差。

1.1.3.2 熒光定量PCR 熒光定量PCR是美國Applied Biosystems公司于1996年推出的定量實驗技術(shù)，它通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針標記跟蹤PCR產(chǎn)物，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件分析產(chǎn)物，計算待測樣品模板的初始濃度。Ye［12］等在用免疫－PCR檢測萘時，采用了熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，其方法是在產(chǎn)物擴增時加入熒光標記的探針，使用熒光定量PCR儀實時監(jiān)控，結(jié)合相應(yīng)軟件分析擴增產(chǎn)物，最低檢測限達1fg/mL。該法操作簡單，靈敏度高，準確性好，但需特殊設(shè)備，價格昂貴。

1.1.3.3 PCR－ELISA 即用ELISA來檢測PCR產(chǎn)物。在PCR擴增后，借助ELISA反應(yīng)原理，使用酶標抗體，在微孔板上進行固相雜交來實現(xiàn)定量。Niemeyer［13］等用免疫－PCR檢測乙肝病毒表面抗原，其PCR產(chǎn)物分別通過瓊脂糖凝膠電泳、直接熒光染料染色以及ELISA分析。對于ELISA，作者采用了兩種顯色底物作為對比，其方法是將系列稀釋的兔IgG包被在微孔板上，生物素化的鼠單抗、鏈親和素以及生物素化的DNA按順序加樣、孵育、洗滌，而后進行PCR擴增，擴增時加入地高辛標記的dNTP，最終檢測用堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體，采用的底物分別為 pNPP(para－nitro－phenylphosphate，亞硝基磷酸單苯酯)或熒光素Attophos。結(jié)果表明瓊脂糖凝膠電泳、直接熒光染料染色的靈敏度分別為2×10－1和6.8×10－3ng/mL，用 pNPP 和 Attophos 作 底 物 的ELISA 靈敏度分別為 1.1 ×10－3和 3.2 ×10－5ng/mL。該法靈敏度高，特異性好，但操作繁瑣，易引起假陽性。

1.2 IPCR的類型

目前IPCR已發(fā)展了許多不同類型，其介紹見表1。

除上表介紹的幾種IPCR技術(shù)外，Joo［26］等建立了一種新穎的免疫－PCR技術(shù)來檢測小分子，學(xué)術(shù)上稱作實時PCR分析噬菌體－抗原抗體復(fù)合物(phage anti－ immunocomplex assay real－ time PCR，PHAIAPCR)，即先將一段短的肽環(huán)展示到噬菌體表面，然后該多肽特異性綁定到抗原抗體復(fù)合物上，這樣就可以進行非競爭檢測小分子，用噬菌體編碼的這段肽可以被PCR擴增，這種方法消除了半抗原與DNA的交聯(lián)作用，提高了檢測靈敏度。Jonas［27］等建立了用納米粒放大的免疫－PCR檢測呼吸多核病毒，在PCR擴增標記物之前，進行50倍的納米價的放大步驟，結(jié)果表明這種方法比傳統(tǒng)的ELISA靈敏度高出了4000倍。張偉華［28］等初步建立了一種全新的核酸信標配基介導(dǎo)的新型免疫－PCR檢測方法，采用了SELEX(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment，指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化)技術(shù)從隨機寡核苷酸文庫中篩選抗體的Fc片段特異寡核苷酸配基，設(shè)計并合成了信標配基，通過不對稱PCR法制備了IgG Fc片段的核酸信標分子，并用32P標記，制備了IgG Fc特異性寡核苷酸信標配基－抗體復(fù)合檢測分子，結(jié)果表面該復(fù)合檢測分子有效完成了信號傳遞和實時定量PCR信號放大過程，可有效提高現(xiàn)有IgG類抗體免疫檢測的靈敏度和特異性。此外還有T7 RNA聚合酶擴增的免疫－PCR技術(shù)，滾環(huán)DNA擴增的免疫－PCR技術(shù)等。

2 IPCR的應(yīng)用領(lǐng)域

IPCR因其高靈敏性，已被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、動物疾病診斷、農(nóng)業(yè)、環(huán)境科學(xué)、食品安全等各個領(lǐng)域。

2.1 臨床醫(yī)學(xué)

免疫PCR的高敏感性使低于常規(guī)檢測方法極限的痕量抗原的檢測成為可能。目前，主要用于檢測病毒抗原(如人類免疫缺陷病毒、禽流感病毒、志賀病毒等)、各種細胞因子(如白細胞介素、腫瘤壞死因子等)、癌癥(如胃癌、鼻咽癌等)、神經(jīng)毒素等等。Zhang［29］等用免疫－PCR檢測中國高危人群血清中與胃癌相關(guān)的MG7－Ag物質(zhì)，從而診斷胃癌，該方法檢測胃癌的靈敏度為77.5%，特異性為95.62%，準確度為73.12%。蒲榮［30］等建立了診斷早期梅毒的免疫－PCR方法，并將其與 ELISA、TPPA(treponema pallidum particle assay，梅毒螺旋體被動明膠顆粒凝集實驗)、TURST(syphilis toluidine red untreated serum test，梅毒甲苯胺紅不加熱血清實驗)進行比較，對其靈敏度、特異性、重復(fù)性進行評價，結(jié)果表明免疫－PCR檢測梅毒螺旋體敏感性高(比ELISA敏感性強 103倍，比 TPPA、TURST強105倍)，特異性強(免疫－PCR、ELISA、TPPA、TURST的特異性分別為100%、98%、100%、95%)，重復(fù)性好，可作為診斷早期梅毒的方法。Malou［31］等首次采用免疫－PCR檢測鼠疫桿菌抗原，它能夠檢測的蛋白濃度比普通ELISA低70倍，在檢測的34例牙髓中，免疫PCR檢測出14例，PCR法檢測出10例，ELISA法僅檢測出3例。Hashimoto［32］等采用免疫－PCR定量大腦內(nèi)引發(fā)老年癡呆癥的淀粉質(zhì)的β肽，結(jié)果表明免疫－PCR可檢測低至2×10－8mol/μL的淀粉質(zhì)β肽。

2.2 動物疾病診斷

隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，動物疾病的發(fā)生與流行形勢日趨嚴峻，因此實現(xiàn)對動物疾病的快速靈敏地診斷有著重要的意義。Ozaki［33］等用免疫－PCR方法診斷馬的流行性感冒抗原，結(jié)果表明免疫－PCR檢測的靈敏度比 RT－PCR高10倍。Ding［34］等用金標納米粒改良的免疫－PCR技術(shù)檢測口蹄疫疾病病毒，目標病毒顆粒被多克隆抗體包被的ELISA微板捕捉，然后加入金標納米顆粒修飾的寡核苷酸及口蹄疫病毒的特異性單克隆抗體，形成一個夾心免疫復(fù)合物，經(jīng)過PCR擴增后，信號DNA被釋放并用實時PCR識別，結(jié)果表明傳統(tǒng) ELISA的檢測限為100ng/mL，而該方法的檢測限低至10－5ng/mL。

2.3 農(nóng)業(yè)方面

人們對植物病變及各種殺蟲劑的危害已越發(fā)關(guān)注，提高對此類物質(zhì)的檢測靈敏度十分必要。Rajesh［18］等用免疫－PCR檢測轉(zhuǎn)基因玉米中的植物源殺蟲劑蛋白，檢測限達 1ng/mL。Silva［35］等用免疫－PCR的方法檢測蘇云金桿菌殺蟲劑Cry1Ac的毒性，該實驗采用聚氯乙烯微滴定板及鏈霉素包被顆粒為載體，在其表面進行抗原抗體反應(yīng)，結(jié)果表明該方法對毒素的最低檢測限為21.6ng/μL。

2.4 環(huán)境科學(xué)

環(huán)境問題已成為一個國際化關(guān)注的問題，各種污染已給人類造成了很大的困擾，生活環(huán)境的污染對人類的健康極其不利，急需建立快速靈敏的方法來監(jiān)控環(huán)境中的有害物質(zhì)。He［36］等用夾心實時定量免疫－PCR的方法檢測環(huán)境中的志賀毒素2及其變種，結(jié)果表明該方法在磷酸緩沖液環(huán)境下的檢測限為0.1pg/mL，其定量范圍為10～100000pg/mL，在相同環(huán)境下，其靈敏度是傳統(tǒng) ELISA的10000倍。Chen［37］等用實時免疫－PCR檢測土壤樣品中的多氯聯(lián)苯類物質(zhì)，在最優(yōu)的條件下，得到的最低檢測限為5fg/mL。

2.5 食品安全

民以食為天，食品安全是最基本的民生問題。在食品安全領(lǐng)域，食源性致病菌、抗生素、農(nóng)獸藥殘留和生物毒素污染的檢測，以及轉(zhuǎn)基因食品的監(jiān)控備受公眾關(guān)注。許多致病菌和抗生素等的殘留都是微量的，因此免疫－PCR吸引了眾多研究者的目光。Dinesh［9］等建立了免疫磁珠捕獲實時定量PCR技術(shù)檢測黃曲霉毒素B1，分別采用了單克隆抗體直接夾心和多克隆抗體間接夾心免疫PCR檢測，結(jié)果表明最好的方法是用單克隆抗體捕捉的直接夾心法，其檢測范圍為 0.1～10ppb，相關(guān)性為 0.97，效能為99.5%，這為免疫－PCR檢測食品中小分子抗原奠定了基礎(chǔ)。He［38］等建立了免疫－PCR技術(shù)檢測牛肉、液態(tài)雞蛋及牛奶中的蓖麻毒素，結(jié)果表明用IPCR檢測雞蛋、牛奶、牛肉的檢測限分別為10、10、100pg/mL，而用傳統(tǒng)ELISA檢測雞蛋、牛奶、牛肉的檢測限分別為 104、103、103pg/mL。Rajkovic［39］等分別用 ELISA 和定量免疫－PCR方法分別檢測含1%BSA(bovine serum albumin，牛血清蛋白)的PBS(phosphate buffer solution，磷酸鹽緩沖液)及半脫脂牛奶中的肉毒桿菌神經(jīng)毒素(Clostridium botulinum neurotoxins，BoNT)A、B，結(jié)果表明用ELISA檢測BoNT/A的檢測限分別為15、30ng/mL，檢測 BoNT/B的檢測限分別為15、30ng/mL;用定量免疫－PCR檢測BoNT/A的檢測限均為0.09ng/mL，檢測BoNT/B的檢測限分別為0.37、0.75pg/mL。Leenalitha［40］等采用了免疫－PCR 信號放大技術(shù)分別檢測牛奶、檸檬奶油派、金槍魚沙拉及火雞中的金黃色葡萄球菌腸毒素，其檢測限均低至7.5fg/mL。

3 展望

近幾年，免疫－PCR憑借其無可比擬的高靈敏性在各個領(lǐng)域得到了迅猛的發(fā)展，逐漸走向標準化，該技術(shù)與其它技術(shù)(如噬菌體展示)［10，28］的結(jié)合已成為發(fā)展的趨勢。

目前，國內(nèi)外檢測食品中小分子抗原的研究應(yīng)用報道主要局限于液相色譜、質(zhì)譜、酶聯(lián)免疫分析法等，然而對一些小分子抗原的痕量檢測無法達到國內(nèi)外規(guī)定的最低檢測限。考慮到日益成熟的免疫－PCR的高靈敏性及高特異性，本文認為免疫－PCR方法是分析測定食品中小分子抗原殘留可行的篩選方法，值得大力推廣應(yīng)用。研制針對食品領(lǐng)域的試劑盒，標準化IPCR的操作，使其實現(xiàn)商品化生產(chǎn)，對食品領(lǐng)域有著重大意義。

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