木瓜蛋白酶酶解黑豆制備多肽

鄭鴻雁，王 玉

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118)

黑豆，民間多稱黑小豆和馬科豆，有豆中之王的美稱。黑豆在國外研究較少，國內(nèi)已有初步研究。黑豆防老抗衰，藥食俱佳，與黃豆同屬大豆類。黑豆具有高蛋白、低熱量的特性，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)36%～40%［1］。研究表明［2］，黑豆除富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)外，蛋白質(zhì)水解后的多肽也含有許多的抗氧化成分，多肽易吸收還可以降低膽固醇等作用［3－4］。利用蛋白酶水解大豆蛋白，可以得到肽、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，大大提高了大豆蛋白的營養(yǎng)價(jià)值［5］。酶水解法條件溫和且不會(huì)造成環(huán)境污染［6］，所以本實(shí)驗(yàn)采用木瓜蛋白酶對(duì)黑豆豆粕進(jìn)行水解，研究了制備多肽的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑豆豆粕粉 吉林公益源有機(jī)食品有限公司;木瓜蛋白酶(400U/mg) 北京鼎國生物試劑有限公司;四肽(Gly－Gly－Tyr－Arg) Sigma 公司;雙縮脲試劑、三氯乙酸、氫氧化鈉 均為分析純。

水浴鍋 國華電器有限公司;721型可見光分光光度計(jì) 尤尼科公司;低溫高速臺(tái)式離心機(jī) 赫莫;分析天平 sartouris。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多肽含量測定

1.2.1.1 四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 先用5%TCA配置成1.8mg/mL的四肽溶液，然后再用此四肽溶液配制成濃度為 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mg/mL的四肽溶液。各吸取3mL溶液放入對(duì)應(yīng)空試管中，分別加入2mL雙縮脲試劑，混勻，靜止顯色30min。分別于540nm下測吸光度值，以第一管為空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。以四肽濃度為橫坐標(biāo)值，吸光度值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線［7］。

1.2.1.2 多肽轉(zhuǎn)化率的測定 酶解完成后加入10mL 10%TCA 溶液［8］，靜止 10min 后 3000r/min 離心10min，上清液為多肽溶液。取上清液1mL于試管中，加入2mL蒸餾水，加入雙縮脲試劑2mL，顯色30min后在540nm下測吸光度值。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出上清液中黑豆多肽的含量，計(jì)算多肽轉(zhuǎn)化率。

A:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出的橫坐標(biāo)濃度，mg/mL;B:豆粉克數(shù)，g;110:為100mL蒸餾水和10mL三氯乙酸;3:為倍數(shù)，1mL離心上清液加2mL蒸餾水相當(dāng)于上清液稀釋了3倍;50%:脫脂豆粉蛋白質(zhì)含量為50%。

1.2.2 多肽溶液的制備 將一定量的黑豆豆粕粉加入到100mL蒸餾水中，配制成不同濃度的豆粕粉溶液，以2%的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH等于6在水浴鍋中加熱攪拌。反應(yīng)過程中用2%NaOH維持pH，溫度恒定。酶解一定時(shí)間后即為多肽溶液。

1.2.3 制備多肽溶液單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 加酶量對(duì)多肽轉(zhuǎn)化率的影響 在100mL蒸餾水中加入2g黑豆豆粕粉，配制成0.02g/mL的豆粕粉溶液，保持pH等于6［9］，并且溫度保持在55℃，酶解時(shí)間為 6h，分別選擇 20000、25000、30000、35000、40000、45000U/g(U/g為酶活與底物質(zhì)量比)的木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解黑豆豆粕制備多肽溶液，考察各組多肽的轉(zhuǎn)化率。

1.2.3.2 豆粕粉濃度對(duì)多肽轉(zhuǎn)化率的影響 在100mL 蒸餾水中分別加入 1、2、4、6、8、10g 的黑豆豆粕粉，分別配制成 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08g/mL 的豆粕粉溶液，加入木瓜蛋白酶，酶活為35000U/g(酶活/底物質(zhì)量)，保持pH等于6，溫度保持在55℃，酶解時(shí)間為6h。考察各組多肽的轉(zhuǎn)化率。

1.2.3.3 溫度對(duì)多肽轉(zhuǎn)化率的影響 在100mL蒸餾水中加入2g黑豆豆粕粉，配制成0.02g/mL的豆粕粉溶液，木瓜蛋白酶酶活為35000U/g，保持pH等于6，酶解時(shí)間為6h。分別選擇溫度為50、55、60、65℃條件下酶解黑豆豆粕制備多肽溶液，考察各組多肽的轉(zhuǎn)化率。

1.2.3.4 酶解時(shí)間對(duì)多肽轉(zhuǎn)化率的影響 在100mL蒸餾水中加入2g豆粕粉，配制成0.02g/mL的豆粕粉溶液，酶解溫度保持在55℃，木瓜蛋白酶酶活為35000U/g，保持pH等于6。分別選擇酶解時(shí)間為4、6、8、10h，考察各組多肽的轉(zhuǎn)化率。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇單因素最優(yōu)的條件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解黑豆豆粕制備多肽溶液的最佳工藝條件。實(shí)驗(yàn)正交分析表見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)正交分析表Table1 Orthogonal analysis of experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線

以四肽濃度為橫坐標(biāo)x(mg/mL)，OD值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，得回歸方程y=0.209x－0.005，R2=0.9991。

2.2 酶活對(duì)黑豆多肽轉(zhuǎn)化率的影響

加酶量對(duì)黑豆多肽得率的影響如圖2所示。由圖2可以看出，當(dāng)加酶量小于35000U/g時(shí)，由于酶活沒有達(dá)到最適值，所以多肽轉(zhuǎn)化率隨著加酶量的增加而上升;當(dāng)加酶量達(dá)到35000U/g時(shí)，多肽轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大;當(dāng)加酶量大于35000U/g時(shí)，多肽轉(zhuǎn)化率略有下降。所以當(dāng)加酶量為35000U/g時(shí)，多肽含量最高。

2.3 豆粕粉濃度對(duì)多肽轉(zhuǎn)化率的影響

圖1 四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Four peptide standard curve

圖2 加酶量對(duì)黑豆多肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of enzymes content on the yield of black beans peptide

圖3 豆粕粉濃度對(duì)多肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of soya meal concentration on the yield of peptide conversion

豆粕粉濃度對(duì)多肽轉(zhuǎn)化率的影響如圖3所示。由圖3可以看出，當(dāng)豆粕粉濃度為0.01g/mL時(shí)，多肽轉(zhuǎn)化率最高;隨著豆粕粉濃度增大，多肽轉(zhuǎn)化率下降。酶需要在水溶液環(huán)境下與特異結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生作用，當(dāng)豆粕粉濃度增大時(shí)，豆粕含量增加，影響了水溶液的濃度，蛋白分子容易聚集，使酶不能很好酶解蛋白分子，所以當(dāng)豆粕粉濃度升高時(shí)，肽轉(zhuǎn)化率反而下降。

2.4 酶解溫度對(duì)多肽轉(zhuǎn)化率的影響

酶解溫度對(duì)多肽轉(zhuǎn)化率的影響如圖4所示。由圖4可以看出，當(dāng)酶解溫度小于55℃時(shí)，多肽轉(zhuǎn)化率隨著溫度的上升而增大;當(dāng)酶解溫度為55℃時(shí)，多肽轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大;當(dāng)酶解溫度大于55℃時(shí)，多肽轉(zhuǎn)化率隨著溫度上升而略有下降。酶作用于底物時(shí)需要一定的溫度，當(dāng)小于或大于這個(gè)溫度時(shí)酶都不能達(dá)到最大的酶活力，木瓜蛋白酶的最適溫度為55℃，所以在最適溫度下多肽轉(zhuǎn)化率最高。

2.5 酶解時(shí)間對(duì)多肽轉(zhuǎn)化率的影響

圖4 酶解溫度對(duì)多肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of temperature on the yield of the peptide conversion

酶解時(shí)間對(duì)多肽轉(zhuǎn)化率的影響如圖5所示。由圖5可以看出，當(dāng)酶解時(shí)間小于6h時(shí)，多肽轉(zhuǎn)化率隨著酶解時(shí)間的增加而增大;當(dāng)酶解時(shí)間為6h時(shí)，多肽轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大;當(dāng)酶解時(shí)間大于6h時(shí)，多肽轉(zhuǎn)化率下降。木瓜蛋白酶酶解黑豆豆粕粉成短鏈的多肽，隨著酶解時(shí)間的增加，當(dāng)酶解時(shí)間小于6h時(shí)，蛋白質(zhì)被酶解成多肽，所以多肽含量上升。但是隨著時(shí)間的繼續(xù)增長，酶解時(shí)間大于6h，多肽又被木瓜蛋白酶酶解成氨基酸，所以多肽含量有所下降。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)多肽轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of time on the yield of peptide conversion

2.6 制備黑豆多肽條件的優(yōu)化

制備黑豆多肽正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析見表2。由表2可以看出，各因素對(duì)黑豆多肽制備的影響順序由大到小為:溫度＞時(shí)間＞豆粕粉濃度＞加酶量。各因素的優(yōu)組合為豆粕粉濃度為0.01g/mL，溫度為60℃，加酶量為40000U/g，酶解時(shí)間為7h。

最優(yōu)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，平均多肽轉(zhuǎn)化率為63.53%，高于正交實(shí)驗(yàn)中各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此證明木瓜蛋白酶酶解黑豆豆粕粉的最佳條件為豆粕粉濃度0.01g/mL，溫度為60℃，加酶量為40000U/g，酶解時(shí)間為7h時(shí)，多肽轉(zhuǎn)化率為63.53%。

3 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)所涉及的因素水平范圍內(nèi)，以多肽轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)分析優(yōu)化了多肽的提取工藝，從而得到了木瓜蛋白酶酶解黑豆豆粕粉的最佳工藝條件為豆粕粉濃度為:0.01g/mL，溫度為60℃，加酶量為40000U/g，酶解時(shí)間為7h時(shí)。各因素對(duì)其影響順序?yàn)?溫度＞時(shí)間＞豆粕粉濃度＞加酶量。在最佳工藝條件下，多肽轉(zhuǎn)化率為63.53%。實(shí)驗(yàn)提取條件簡單、易行、經(jīng)濟(jì)，適合工廠大規(guī)模生產(chǎn)，過程易于控制，具有良好的開發(fā)和利用前景。

表2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果正交分析表Table2 Orthogonal analysis of experiment results

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