以離子液體作流動相添加劑高效液相色譜法分離辣椒素類生物堿

邊 敏，楊 勇，周 昊

(1．南京工業(yè)大學 理學院，江蘇 南京 210009;2．南京中醫(yī)藥大學 藥學院，江蘇 南京 210046)

辣椒素類生物堿是一類由茄科植物辣椒的成熟果實中提取得到的辛辣有效成分，主要包括辣椒堿(Capsaicin，CAP)、二氫辣椒堿(Dihydrocapsaicin，DHC)和降二氫辣椒堿(Nordihydrocapsaicin，NDHC)，其中辣椒堿與二氫辣椒堿為辣椒中的主要成分，約占辣椒總含量的90%［1］。3種化合物結構式見圖1。

圖1 辣椒素類生物堿的化學結構式Fig.1 Chemical structures of capsaicin-type alkaloids

目前辣椒素類生物堿在臨床上已有較多應用［2－5］，分離測定方法主要有HPLC、GC－MS和LCMS［6－8］。其中GC－MS在測定時為增加樣品的揮發(fā)性，需要提前衍生化，LC－MS的測定成本較高，故辣椒素類生物堿的分離測定以液相色譜為主。為了提高分離度，現(xiàn)多采用增加色譜柱長度和梯度洗脫的方法來實現(xiàn)分離。本課題組前期的研究結果表明，以室溫離子液體(RTILs)為流動相添加劑分離生物堿可獲得良好的分離效果［9］，故本研究擬利用離子液體作為流動相添加劑分離辣椒素類生物堿，考察分離條件及影響因素，并利用溶質計量置換保留模型(SDM－R)，初步探討分離機理，為此類生物堿的分離提供了新的方法和思路。

1 溶質計量置換保留模型

溶質計量置換保留模型的簡化數學表達式為［10］:

其中k'為容量因子，αD為流動相中置換劑的活度，線性參數lgI和Z均為常數。lgI表示1 mol溶質對固定相的親和勢，Z表示1 mol溶劑化溶質被溶劑化固定相吸附時在兩者的接觸表面上釋放出置換劑的摩爾總數。

根據該模型，實驗中分別考察了甲醇及離子液體濃度變化與組分容量因子的關系，以此確定在此保留過程中的置換劑，初步探討離子液體在分離過程中的作用機理。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Shimadzu高效液相色譜系統(tǒng):LC－20AD泵，SPD－20A檢測器，7125進樣器，Class－VP色譜工作站。pHs－3C精密pH計、E－201－C pH復合電極(上海精密科學儀器有限公司)。

辣椒堿、二氫辣椒堿標準品(美國Sigma公司);離子液體CnminBF4(n=1、2、4、6、8、10、12)，1-丁基-3-甲基咪唑氯化鹽(BmimCl)根據文獻報道合成［11－12］，經莫爾法、分光光度法測定純度大于97%;甲醇(色譜純，Concord);磷酸(優(yōu)級純，國藥集團化學試劑公司);實驗用水為三蒸水(自制)。

2.2 實驗方法

2.2.1 溶液的配制 分別精密稱取辣椒堿、二氫辣椒堿標準品適量，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得辣椒堿質量濃度為407 mg·L－1、二氫辣椒堿質量濃度為411 mg·L－1的標準品貯備液。移取兩種貯備液各5.0 mL至250 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，搖勻得標準品混合液。標準溶液保存于4℃冰箱內。使用時放至室溫，過0.45 μm濾膜。

2.2.2 色譜條件 色譜柱:ODS柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent TC－C18)，等度洗脫，流動相:甲醇－水(30∶70)，流速:0.7 mL·min－1，檢測波長:280 nm，柱溫:25℃。另向流動相中以5.2 mmol·L－1的濃度加入 BmimBF4。

3 結果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

分別以甲醇－水(30∶70)、甲醇－水(40∶60)、甲醇－水(30∶70，加入BmimBF4作添加劑)為流動相，考察了不同流動相體系對辣椒素類生物堿的保留效果及影響(見圖2)。由圖可知:①CAP與DHC在無添加劑的甲醇－水系統(tǒng)中即可達基線分離，峰形基本對稱(圖2A、B)。這是因為兩者在結構上僅飽和度不同，與DHC相比，CAP增加1個不飽和雙鍵，保留減小。同時由于其堿性較弱，在此分離條件下多數呈非質子化形式，與反相柱的殘余硅羥基作用較弱，故幾乎無拖尾;②CAP與NDHC在無添加劑流動相體系中無法達到基線分離(圖2A、B)。這是因為與CAP相比，NDHC雖然少了不飽和雙鍵，保留增大，但同時碳鏈變短，疏水性減弱，保留減小。總的作用結果使得兩者在甲醇－水體系中的保留特性接近;③在流動相中加入低濃度的BmimBF4(5.2 mmol·L－1)后，可使CAP在NDHC之前出峰，并達到基線分離，同時3種生物堿的保留均有所減小，峰形得到改善，分離效率顯著提高(圖2C)。說明在此類生物堿的分離過程中，離子液體的加入使各組分的保留減小，但同時也可選擇性地使NDHC的保留相對增大，提高了其與CAP的分離度。

圖2 辣椒素類生物堿的色譜圖Fig.2 Chromatograms of capsaicin type alkaloids

3.2 流動相中甲醇含量對分離特性的影響

根據公式(1)，如將有機溶劑設為置換劑，且有機溶劑濃度與組分保留值之間呈線性關系，則說明有機溶劑是優(yōu)先將固定相溶劑化，并作為流動相的強溶劑在分離過程中起主導作用，而離子液體的作用則以離子對試劑為主。將室溫離子液體設為置換劑，若離子液體的濃度與組分保留值滿足公式(1)，即說明在整個分離過程中，離子液體優(yōu)先被吸附到固定相上，將固定相溶劑化，其與被分離組分之間的作用以競爭吸附為主。故在實驗中，分別配制含不同比例甲醇的流動相，考察有機相比例對分離的影響。結果見圖2A、B。當甲醇含量降低時，組分的保留相應增強，分離度略有提高，但無法使CAP與NDHC達到基線分離。向流動相中加入5.2 mmol·L－1的BmimBF4，并分別配制體積比為25∶75、30∶70、35∶65、40∶60的甲醇－水流動相，考察甲醇含量對組分保留的影響。結果顯示各組分的保留隨甲醇含量的減少而增加，分離效率基本不變。根據式(1)，將組分容量因子與甲醇體積比求對數線性關系，得SDM－R線性參數(見表1)。

表1 甲醇作置換劑時SDM－R各參數值Table 1 Stoichiometric parameters of different analytes with methanol as displacer

結果顯示，在此分離系統(tǒng)中，若以甲醇為強溶劑，并作為分離過程中的置換劑，組分容量因子與甲醇濃度之間的對數線性關系較差(r＜0.9)。說明在此吸附保留過程中，甲醇對固定相的溶劑化作用并不占主導地位，不參與組分在固定相上的競爭吸附。即在此流動相體系中，甲醇僅作為洗脫劑，改變流動相的洗脫能力，但并未參與組分的競爭吸附和保留過程。

圖3 BmimCl為添加劑時的分離色譜圖Fig.3 Chromatogram of capsaicin-type alkaloids with mobile phase containing BmimCl

3.3 離子液體種類的選擇

分別考察了不同烷基鏈長度陽離子和不同離液序列陰離子對分離的影響。結果發(fā)現(xiàn)，當離子液體陰離子為低離液序列的Cl－時，無論烷基鏈長度如何變化，均無法實現(xiàn)CAP與NDHC的基線分離，結果見圖3。

由圖3可見，雖然各組分的峰形明顯改善，分離效率提高，但NDHC仍在CAP前出峰，且未達基線分離。只有當陰離子離液序列較高時(如，)，兩者的出峰順序改變，并達到基線分離。這可能是因為NDHC與CAP的結構中相差一個不飽和雙鍵，其形成的π電子云與p－π電子云共軛，導致CAP支鏈上局部電子云密度下降，堿性降低。故在相同化學環(huán)境下，CAP大部分以中性分子形式存在，僅有少部分質子化，且質子化的比例小于NDHC。當高離液序列陰離子存在時，CAP形成離子對的比例小于NDHC，保留減小。而低離液序列陰離子無法形成中性離子對［13－14］，故無法使兩個堿性略有差異的組分分離。因此，本實驗采用高離液序列陰離子組成的離子液體，即CnminBF4為添加劑，并進一步考察了CnminBF4鏈長變化對分離特性的影響，結果見表2。

表2 不同烷基鏈長離子液體作添加劑分離辣椒素類生物堿的色譜參數值Table 2 Chromatographic parameters with RTILs having different length of alkyl groups as a dditives

由表2可見，隨著烷基鏈長度(n)的增加，各組分的容量因子減小，同時有效理論塔板數增大，CAP與NDHC的分離度先增大后減小。這可能是因為隨著烷基鏈長度的增加，離子液體的疏水性增大，導致離子液體與固定相表面的吸附力更強，與組分競爭吸附的能力增大;同時離子液體的表面張力減小，流動相的表面張力隨之減弱且洗脫力增加，組分保留減小。若以有效理論塔板數和分離度為指標衡量分離效率，對于pKa＜2的酰胺類生物堿，由高疏水性的長烷基鏈陽離子和高離液序列陰離子組成的離子液體更適合，且分離時間短、分離效率高。

3.4 離子液體濃度的影響

改變離子液體BmimBF4的濃度(2.6～83.4 mmol·L－1)，考察了各組分保留的變化，結果見表3。由表3可見，各組分的保留隨離子液體濃度的增大而減小。

表3 不同濃度下不同烷基鏈長的離子液體作添加劑時各組分的保留值Table 3 Chromatographic parameters with RTILs having different length of alkyl groups and different concentration as additives

將lgk'～lgαD求線性，得SDM－R第一線性方程，各參數值見表4。由表4可見，當n=10時，組分保留隨離子液體濃度變化的線性關系下降(r＜0.99)，說明當烷基鏈長度增加到一定值時，離子液體在固定相上的親和勢增大，形成的溶劑化層不再是理想的單分子層，組分被吸附至固定相時，被置換到溶液中的溶劑分子數目不再遵循SDM－R中的線性關系。

此外，n=4～8的良好線性關系表明，相比于苦參類生物堿［9］，酰胺類生物堿的lgk'與lgαD的線性擬合程度更高，基本可達到r＞0.99。這是因為此類生物堿的堿性更弱，在分離過程中以非質子化中性分子存在的比例更多，組分與離子液體的置換吸附作用更強，所以線性關系更明確。該結果進一步證明了當離子液體作添加劑時，非質子化組分分子與離子液體置換劑之間的作用符合SDM－R。

表4 離子液體濃度變化時各組分SDM－R模型的參數值Table 4 Stoichiometric parameters of different analytes with different concentration ionic liquids as displacer

圖4 柱溫的影響Fig.4 Effect of column temperature

3.5 柱溫的影響

考察了柱溫(298、303、308、313 K)對組分保留的影響。根據范特霍夫方程(lgk'=ΔH/(RT)+ΔS/(RT)+lgφ)，將各組分容量因子的對數與柱溫的倒數進行線性擬合，結果見圖4。由圖可知，柱溫升高導致各組分的容量因子依次降低。以lgk'～1/T作圖，可得良好的線性關系，符合范特霍夫公式。造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于溫度對各組分電離常數的影響所致。即隨著溫度升高，電離常數減弱，形成質子化的比例減小，相應的中性離子對的比例減小，保留減小。故在保證分離度的前提下，此類生物堿的分離可選擇在一定溫度下進行，本實驗選擇柱溫25℃。

4 結論

本文首次以離子液體為添加劑，建立了以辣椒堿、二氫辣椒堿與降二氫辣椒堿為代表的酰胺類生物堿的分離分析方法，并考察各種因素對分離的影響，利用各組分的色譜參數值建立分離模型，初步探討其分離機理。結果表明當向流動相中加入由高疏水性的長烷基鏈陽離子和高離液序列陰離子組成的離子液體時，各組分的峰形得到改善，分離效率明顯提高，同時保留減弱。此外，離子液體作為置換劑，其鏈長、濃度與組分保留值的變化與SDM－R擬合程度較好，即分離作用過程完全符合溶質計量置換模型。

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