一種基于硝酸纖維素膜的新穎便捷的芯片對循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高效捕獲

張鵬，孫長龍，張人，高明霞，2*，張祥民，2*

(1.復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系，上海 200433;2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200433)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)是指那些從腫瘤組織上脫落下來并進入血液全身循環(huán)的癌細(xì)胞。它由普通癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來，并且隨時可以通過逆分化再次長出腫瘤組織，因此它與癌癥的擴散和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是反映癌癥病情發(fā)展的風(fēng)向標(biāo)，對其進行詳盡研究對于癌癥的早期診斷與治療具有決定性的意義［1］。人體外周血液中CTC的含量很低，一般不會超過100個/mL，而其中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞等背景干擾細(xì)胞則高達109個，這對現(xiàn)有的分離分析方法來說是一個巨大的挑戰(zhàn)［2，3］?？偟膩碚f，目前的研究亟須解決兩個方面的問題:一是怎樣把數(shù)量如此少的CTC 從背景如此復(fù)雜的人血中分離出來;二是如何對分離的少量CTC 進行高靈敏的檢測計數(shù)和后續(xù)的生化分析。

近十年來，關(guān)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離捕集研究受到了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注，一系列研究成果也相繼被報道。美國強生公司推出了基于免疫磁珠分離的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測與分析系統(tǒng)(CellSearchTM)［4］，率先得到了美國食品藥品管理局(FDA)的認(rèn)證并已廣泛用于臨床診斷，不過費用昂貴，而且假陽性率比較高。近來微流控芯片成為CTC 分離研究的熱點，Nagrath 等［5，6］報道了基于上皮細(xì)胞粘附分子(Ep-CAM)抗體組裝的微流體芯片陣列，對相應(yīng)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有很高的捕獲效率;Hosokawa 等［7，8］基于癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的形態(tài)差異，制成了體積排阻分離裝置，擴展了CTC 研究的思路;國內(nèi)的王樹濤等［9，10］也基于硅板表面的納米纖毛與癌細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)相互作用，開發(fā)了一種硅板芯片，其對癌癥病人血液樣本的檢測效果要好于當(dāng)前的CellSearchTM系統(tǒng)。目前報道的這些關(guān)于CTC 芯片的最新研究成果對CTC的捕集效率較高，假陽性也控制得不錯，但是芯片的制備過程大多太復(fù)雜，而且重復(fù)性較差，很難大規(guī)模生產(chǎn)，嚴(yán)重妨礙了其在臨床應(yīng)用上的前景;另外由于芯片孔道的尺寸限制，對病人血液的分析耗時很長，而且捕獲的癌細(xì)胞也不方便進行后續(xù)的再培養(yǎng)等生化分析。

基于以上認(rèn)識，目前CTC的研究真正需要的是一種設(shè)計新穎，制備便捷，分析快速高效的CTC 捕獲芯片。最近各種膜基底平臺［11，12］開始廣受關(guān)注，因此我們設(shè)計了一種以硝酸纖維素膜(NCM)為基底的CTC 高效捕集芯片。硝酸纖維素膜常用于免疫印跡(western blotting)等生化分析中，利用其對蛋白質(zhì)優(yōu)良的吸附效能［13，14］，可以方便地吸附抗體進行CTC 特異性捕獲，簡便高效;另外還可利用其良好的生物親和性和在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的特殊作用，對捕集到的癌細(xì)胞進行生物學(xué)再培養(yǎng)［15］和單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的研究。本研究中用非小肺癌細(xì)胞NCI-H1650作為目標(biāo)靶細(xì)胞，初步驗證了此種CTC芯片的良好捕獲效能，預(yù)示了其在今后臨床應(yīng)用上的光明前景。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

牛血清白蛋白(BSA)、乙醇等購自美國Sigma公司，實驗所用抗體EpCAM CD326購自Biolegend。實驗所用細(xì)胞非小肺癌細(xì)胞NCI-H1650購自中科院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640、磷酸鹽緩沖液(PBS)洗液和優(yōu)級胎牛血清(FBS)來自PAA 公司。硝酸纖維素膜和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)有機玻璃板來自美國Kender 公司。

1.2 實驗步驟

1.2.1 CTC 捕獲芯片的制備

將商品化的硝酸纖維素膜切成1 cm ×1 cm的小塊，然后放入純乙醇中浸泡10 s，讓其軟化透明，并平鋪在預(yù)先剪裁好的PMMA 平板上自然風(fēng)干，裝配成芯片基底。在吸附抗體以前，需要在含10%(v/v)乙腈的1 mmol/L PBS 緩沖液中浸泡1 h 活化;然后把20μL 抗體(0.5μg/μL)溶解在200μL含10%乙腈的1 mmol/L PBS 緩沖液中，均勻滴加在CTC 芯片上，并在37℃下反應(yīng)0.5 h，然后用PBS洗去多余的抗體;再加上50μL的BSA 溶液(0.5%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))封端0.5 h，以降低其對癌細(xì)胞的非特異性吸附。制備好的CTC 芯片保存在4℃冰箱備用。

1.2.2 CTC 芯片抗體吸附量的考察

CTC 芯片上滴加的抗體溶液在37℃反應(yīng)0.5 h后，收集吸附過后的抗體溶液進行高效毛細(xì)管電泳(HPCE)分析，并用未經(jīng)過吸附的抗體原溶液進行對照實驗。使用的毛細(xì)管電泳儀為彩陸CL3030，運行緩沖液為100 mmol/L的磷酸鹽緩沖液;采用虹吸10 s 進樣，分離電壓為10 kV，紫外檢測波長為214 nm，最后根據(jù)抗體的峰面積來計算抗體的相對含量。

1.2.3 CTC 捕集與檢測

非小肺癌細(xì)胞NCI-H1650于含5%(v/v)二氧化碳的37℃恒溫培養(yǎng)箱中，使用添加10%(v/v)胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)成熟后用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))trypsin-EDTA 孵育3 min消化下來，并用PBS 緩沖液洗滌3次后配制成一定濃度的細(xì)胞懸液。把細(xì)胞液滴加在CTC 芯片上，放入37℃恒溫箱孵育一定時間后，用PBS 洗去未捕獲的細(xì)胞，然后進行顯微鏡成像計數(shù)和后續(xù)的檢測。

2 結(jié)果與討論

圖1 CTC 芯片的制備和癌細(xì)胞捕獲整體流程示意圖Fig.1 Schematic illustration of CTC microchip fabrication and cancer cell capture

CTC 芯片的制備和癌細(xì)胞捕獲全過程見圖1，非常簡便可控。傳統(tǒng)的芯片制備多采用化學(xué)共價結(jié)合的方法來固定抗體，不僅抗體固定效率相對較低，而且過程復(fù)雜，大多需要先對芯片表面進行功能化修飾，這也會造成對細(xì)胞的毒性傷害。我們采用的硝酸纖維膜基底，具有良好的生物親和性，在CTC捕集過程中不會對癌細(xì)胞活性產(chǎn)生任何不良影響，這樣可以對捕獲的少量細(xì)胞進行再培養(yǎng)，以便于后續(xù)的生物學(xué)和病理學(xué)研究;硝酸纖維素膜在蛋白質(zhì)組定量和定性研究中也有極大的應(yīng)用，我們可以對捕獲的癌細(xì)胞裂解，然后分析單細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)，從分子水平揭示癌癥的發(fā)展機理;最為重要的是，硝酸纖維素膜對蛋白質(zhì)有很強的吸附效能，我們用其來直接吸附抗體，不僅操作簡便而且效率高。對于CTC 芯片上抗體吸附量的考察，我們采用了HPCE對比分析抗體吸附前和吸附后量的變化(見圖2)。從圖中可看出，芯片吸附前的抗體原液會呈現(xiàn)一個很大的電泳峰，但是吸附后的上清液這個峰完全消失不見，說明硝酸纖維素膜吸附了近乎100%的抗體。通過計算得知其吸附量約為10μg/cm2，如此高的抗體濃度也成為后面優(yōu)異的癌細(xì)胞捕集效率的保證。

圖2 抗體芯片吸附前后的電泳對照圖Fig.2 Electropherograms of antibodies before ＆after CTC microchip adsorption

制好的CTC 芯片實物見圖3d，硝酸纖維素膜用乙醇處理使其透明，便于后面的光學(xué)檢測，也利于固化在支撐載體PMMA 板上。為了測試芯片的捕獲效率，我們用非小肺癌細(xì)胞NCI-H1650配制成50個/μL的癌細(xì)胞懸液，然后滴加在CTC 芯片上，37℃反應(yīng)一定時間后洗掉未吸附的細(xì)胞在明場顯微鏡下進行計數(shù)以驗證其捕獲效率。圖3中a和b 分別是連接了抗體的芯片和未連接抗體芯片的細(xì)胞捕獲對照圖，吸附了抗體的芯片能捕獲到大量的癌細(xì)胞，而未連接抗體的芯片則基本沒有細(xì)胞存在。這一結(jié)果除了充分證明CTC 芯片的捕獲高效能外，還顯示芯片經(jīng)過BSA 封端后非特異性吸附基本上不存在。圖3c 是在同一塊芯片上左邊吸附抗體、右邊不吸附抗體的直接對照實驗，這樣可以完全消除反應(yīng)條件和洗脫時間差異的影響。以紅線為界，左邊吸附了抗體，能捕獲到大量癌細(xì)胞，后邊沒吸附抗體則一個細(xì)胞也沒有，進一步證明了CTC 芯片捕獲的高特異性。

圖3 CTC 芯片的實物圖以及癌細(xì)胞捕獲效果圖Fig.3 Photo of CTC microchip and bright field microscopy images of captured cancer cells in CTC microchips

癌細(xì)胞與CTC 芯片的孵育時間對其捕獲效率影響很大，一般來說抗原抗體特異性反應(yīng)的最佳時間為0.5～1 h，為此我們考察了反應(yīng)5、15、30、45和60 min的效率差異，具體見圖4。從中我們可以看到孵育30 min 后CTC 捕集效率基本不再升高，因而我們后面實驗的孵育時間都設(shè)定為30 min。我們還考察了加入不同細(xì)胞數(shù)量時CTC 芯片的捕獲效率，統(tǒng)計結(jié)果見圖5。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量在400個以上時，捕獲效率都超過了60%，這與當(dāng)前的主流報道結(jié)果［5，9］相當(dāng);當(dāng)細(xì)胞數(shù)量低至20個時我們也能檢測到6個，證明了其對血液中低含量的癌細(xì)胞進行捕集完全可能。

圖4 不同孵育時間下CTC 芯片的捕獲效率Fig.4 Capture yield of CTC microchip at different capture times

圖5 不同數(shù)量癌細(xì)胞的CTC 芯片捕獲效率Fig.5 Capture yield of CTC microchip in different numbers of cancer cells

為了模擬病人血樣中CTC的檢測，我們把500個癌細(xì)胞投入到1 mL 健康人血液中。首先全血進行紅細(xì)胞破裂，初步離心去除上清液以排除大量紅細(xì)胞的干擾，然后用所制備的CTC 芯片對離心沉淀細(xì)胞捕集30 min，用PBS 洗去未捕獲的干擾細(xì)胞，然后進行檢測計數(shù)。結(jié)果共有182個癌細(xì)胞被成功檢測到，檢測效率為36%。當(dāng)然也存在著白細(xì)胞淋巴細(xì)胞也被非特異性吸附的可能，如果輔以本工作后期將要進行的拉曼成像檢測，檢測準(zhǔn)確度將會大大提高。

3 結(jié)論

本研究工作開發(fā)了一種新穎便捷的CTC 捕獲芯片，其對癌細(xì)胞捕獲的高效率已經(jīng)為實驗所證明。CTC 芯片具有制備簡便、價格便宜、分析快速等優(yōu)點，因而在今后大規(guī)模的臨床應(yīng)用中會具有極大的優(yōu)勢。當(dāng)然目前還只是初步研究，在后期的工作中將會結(jié)合表面增強拉曼光譜成像，進一步提高癌細(xì)胞分離及檢測的靈敏度和精度。同時由于硝酸纖維素膜在蛋白質(zhì)組學(xué)方面的重要應(yīng)用，將來也可以直接在CTC 芯片上對捕獲到的單個癌細(xì)胞進行單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)［16］的研究。

［1］Mehlen P，Puisieux A.Nat Rev Cancer，2006，6(6):449

［2］Pantel K，Brakenhoff R H，Brandt B.Nat Rev Cancer，2008，8(5):329

［3］Pantel K，Alix-Panabieres C.Trends in Molecular Medicine，2010，16(9):398

［4］Attard G，Swennenhuis J F，Olmos D，et al.Cancer Res，2009，69(7):2912

［5］Nagrath S，Sequist L V，Maheswaran S，et al.Nature，2007，450(7173):1235

［6］Adams A A，Okagbare P I，F(xiàn)eng J，et al.J Am Chem Soc，2008，130(27):8633

［7］Hosokawa M，Hayata T，F(xiàn)ukuda Y，et al.Anal Chem，2010，82(15):6629

［8］Mohamed H，Murray M，Turner J N，et al.J Chromatogr A，2009，1216:8289

［9］Wang S T，Wang H，Jiao J，et al.Angew Chem Int Ed，2009，121:9132

［10］Wang S T，Liu K，Liu J A，et al.Angew Chem Int Ed，2011，123:3140

［11］Yu W W，White I M.Anal Chem，2010，82(23):9626

［12］Lee C H，Hankus M E，Tian L M，et al.Anal Chem，2011，83(23):8953

［13］Lu Y，Shi W W，Qin J H，et al.Anal Chem，2010，82(1):329

［14］Manimaran M，Jana N R.J Raman Spectro，2007，38(10):1326

［15］Shah A M，Yu M，Nakamura Z，et al.Anal Chem，2012，84:3682

［16］Wang W L，Jin W R.Chinese Journal of Chromatography(王文雷，金文睿.色譜)，2007，25(6):799