基于多級(jí)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組定量新方法新技術(shù)進(jìn)展

張瑩，楊芃原，陸豪杰

(復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系和生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032)

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入和發(fā)展，大量功能蛋白質(zhì)和疾病相關(guān)的潛在蛋白質(zhì)標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)和鑒定。早期蛋白質(zhì)組學(xué)研究比較重視鑒定蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)修飾信息，而越來越多的研究表明，疾病或不同生理狀態(tài)相關(guān)的重要蛋白質(zhì)往往不僅是種類的改變，更多的是蛋白質(zhì)量的改變。因此，從定性走向定量已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組研究的必然趨勢(shì)［1］。

生物質(zhì)譜作為蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)，不僅承擔(dān)著蛋白質(zhì)鑒定的任務(wù)，在蛋白質(zhì)定量中也扮演著更為重要的角色。隨著定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷發(fā)展，越來越多的基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組定量方法應(yīng)運(yùn)而生。從蛋白質(zhì)組定量所要達(dá)到的目的上大致可以分為絕對(duì)定量和相對(duì)定量?jī)纱箢?從蛋白質(zhì)定量所采取的策略上可根據(jù)標(biāo)記的有無分為非標(biāo)記定量和標(biāo)記定量?jī)纱箢?在標(biāo)記定量中普遍采用的是穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)，可以根據(jù)標(biāo)記方法細(xì)分到體內(nèi)代謝標(biāo)記、酶促標(biāo)記和化學(xué)標(biāo)記;還可以根據(jù)質(zhì)譜定量信息來源的不同分為一級(jí)質(zhì)譜(MS1)定量和多級(jí)質(zhì)譜(MSn)定量。

多級(jí)質(zhì)譜定量，顧名思義，其定量信息來自多級(jí)質(zhì)譜譜圖。通常是首先在蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生的肽段上引入穩(wěn)定同位素標(biāo)記，然后比較在多級(jí)質(zhì)譜中帶有同位素標(biāo)記的報(bào)告離子或帶有同位素標(biāo)記的肽段碎片離子的質(zhì)譜峰強(qiáng)度來進(jìn)行蛋白質(zhì)的相對(duì)定量。根據(jù)肽段的不同標(biāo)記方法、實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜碎裂的不同方式以及定量的不同信息，二級(jí)質(zhì)譜定量方法又可以再分為以下幾種:開大窗口二級(jí)質(zhì)譜定量，等重標(biāo)記結(jié)合報(bào)告離子二級(jí)質(zhì)譜定量及相應(yīng)的利用互補(bǔ)離子的二級(jí)質(zhì)譜定量，等重標(biāo)記結(jié)合b、y 離子對(duì)的二級(jí)質(zhì)譜定量。多級(jí)質(zhì)譜定量和一級(jí)質(zhì)譜定量相比，由于經(jīng)過了肽段母離子選擇，大大降低了二級(jí)質(zhì)譜譜圖中的噪聲水平，從而提高了二級(jí)質(zhì)譜譜圖的信噪比，進(jìn)而可以提高肽段和蛋白質(zhì)定量的準(zhǔn)確性。本文將重點(diǎn)綜述基于多級(jí)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組定量新方法、新技術(shù)及它們的應(yīng)用。

1 開大母離子選擇窗口二級(jí)質(zhì)譜定量

開大母離子選擇窗口實(shí)現(xiàn)二級(jí)質(zhì)譜定量是一種比較早期的二級(jí)質(zhì)譜定量方法，常見的適合于一級(jí)質(zhì)譜定量的穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法理論上都可通過開大窗口實(shí)現(xiàn)二級(jí)質(zhì)譜定量。通過開大母離子的質(zhì)量選擇窗口(一般為10 Da)，將一級(jí)質(zhì)譜中輕、重同位素標(biāo)記的肽段同時(shí)選擇進(jìn)行共碎裂，從而在二級(jí)質(zhì)譜中得到輕、重標(biāo)記的成對(duì)碎片離子對(duì)，用這些碎片離子對(duì)來進(jìn)行肽段的定量?；诖x標(biāo)記［2，3］和18O標(biāo)記［4］均可以通過開大母離子選擇窗口在二級(jí)質(zhì)譜中實(shí)現(xiàn)定量。此類方法具有的優(yōu)勢(shì)如下:首先，該方法只需調(diào)節(jié)母離子的選擇窗口即可實(shí)現(xiàn)二級(jí)質(zhì)譜定量，不會(huì)額外增加樣品的預(yù)處理步驟，在操作上易于實(shí)現(xiàn);第二，信噪比較高的二級(jí)譜圖有利于提高定量的靈敏度;第三，譜圖中多對(duì)碎片離子用于定量有效地降低了肽段定量的隨機(jī)誤差，在一定程度上提高了定量的準(zhǔn)確性。但通過開大窗口來實(shí)現(xiàn)二級(jí)質(zhì)譜定量也有很多缺陷導(dǎo)致它不能在復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品中最終被廣泛應(yīng)用，除了因?yàn)檩p、重標(biāo)記的肽段增加了一級(jí)譜圖的復(fù)雜性，最主要的是在二級(jí)質(zhì)譜中，放大的母離子選擇窗口增加了色譜共洗脫質(zhì)量數(shù)相近的干擾肽段發(fā)生共碎裂的幾率，這些對(duì)肽段的鑒定可靠性和定量準(zhǔn)確性均有影響。

2 等重標(biāo)記二級(jí)質(zhì)譜定量

等重標(biāo)記則很好地避免了上述開大窗口定量方法中增加一級(jí)譜圖復(fù)雜性的缺點(diǎn)，特別是避免了開大窗口導(dǎo)致色譜共洗脫質(zhì)量數(shù)相近肽段的干擾問題，提高了定量的靈敏度和準(zhǔn)確度。等重標(biāo)記的二級(jí)質(zhì)譜定量方法可根據(jù)定量離子的來源分為單個(gè)離子和多對(duì)離子定量的方法，其中多對(duì)離子定量方法在很大程度上消除了單個(gè)離子定量時(shí)的不準(zhǔn)確性。

2.1 基于單個(gè)離子定量

2.1.1 基于低質(zhì)量端報(bào)告離子定量

基于單個(gè)離子定量的方法中，最具有代表性的是基于商業(yè)化等重同位素標(biāo)記試劑iTRAQ(isobaric tag for relative and absolute quantitation)［5］和TMT(tandem mass tag)［6］標(biāo)記的定量。這兩種試劑都分為3個(gè)部分:反應(yīng)基團(tuán)、平衡基團(tuán)和報(bào)告基團(tuán)，如圖1所示。反應(yīng)基團(tuán)在每組iTRAQ(以4標(biāo)iTRAQ 為例)或TMT 試劑中的質(zhì)量數(shù)是一致的，報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)通過同位素的巧妙組合在每個(gè)標(biāo)記試劑中各自質(zhì)量數(shù)不相同但這兩者的質(zhì)量數(shù)之和相等，因此，這樣3個(gè)部分的巧妙組合使得整個(gè)標(biāo)記試劑成為“等重標(biāo)記試劑”，即同一肽段經(jīng)過含有不同同位素組合的試劑標(biāo)記后，在一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)質(zhì)荷比完全相同，因此這樣的標(biāo)記不會(huì)增加一級(jí)譜圖的復(fù)雜程度。具體而言，iTRAQ 或TMT 試劑中的反應(yīng)基團(tuán)用于將其標(biāo)記在肽段上，只要有氨基端的肽段至少都會(huì)加上一個(gè)iTRAQ 或TMT 標(biāo)簽，另外賴氨酸(K)的側(cè)鏈氨基也會(huì)被iTRAQ 或TMT 標(biāo)簽標(biāo)記;在對(duì)一級(jí)質(zhì)譜中帶有標(biāo)記的母離子(precursor ion)進(jìn)行碎裂后，會(huì)產(chǎn)生低質(zhì)荷比的報(bào)告離子，這些報(bào)告離子在二級(jí)質(zhì)譜中的強(qiáng)度差異就代表了它所標(biāo)記多肽的相對(duì)豐度;同時(shí)，二級(jí)質(zhì)譜過程中多肽的酰胺鍵斷裂，形成一系列b、y 離子，通過數(shù)據(jù)庫(kù)查詢和比較，可以鑒定出其相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這類試劑中除了反應(yīng)基團(tuán)為NHS(N-羥基琥珀酰亞胺;該基團(tuán)和肽段中的氨基反應(yīng))之外，還有反應(yīng)基團(tuán)是和半胱氨酸反應(yīng)的等重同位素標(biāo)記試劑如cysTMT［7］和iodoTMT［8］，主要用于研究半胱氨酸上的修飾如S-亞硝基化修飾、氧化修飾和二硫鍵的連接等。這類等重同位素標(biāo)記試劑用于蛋白質(zhì)的定量有著明顯的優(yōu)點(diǎn):第一，iTRAQ 試劑可以同時(shí)標(biāo)記多達(dá)8個(gè)樣品，TMT試劑則可以同時(shí)標(biāo)記6個(gè)樣品，因而一次實(shí)驗(yàn)即可實(shí)現(xiàn)多組樣品之間的比較，提高了分析通量;第二，不同樣品來源的同一蛋白質(zhì)的同一個(gè)標(biāo)記肽段在一級(jí)質(zhì)譜上表現(xiàn)為一個(gè)峰，在不增加一級(jí)質(zhì)譜復(fù)雜度的前提下，增強(qiáng)了一級(jí)質(zhì)譜的信號(hào)，進(jìn)一步提高了靈敏度;第三，有研究表明肽段被iTRAQ和TMT 標(biāo)記后，二級(jí)圖譜質(zhì)量更好，產(chǎn)生更加豐富的b、y 離子系列使得蛋白質(zhì)序列覆蓋率提高，鑒定結(jié)果更可靠［9］。iTRAQ和TMT的普遍應(yīng)用為大規(guī)模的蛋白質(zhì)組定量提供了有利的工具，研究者們也對(duì)它們做了較為系統(tǒng)的評(píng)價(jià)。Pichler 等［10］以Hela 細(xì)胞為樣本的研究表明:從蛋白質(zhì)鑒定的角度而言，4標(biāo)iTRAQ 比8標(biāo)iTRAQ 得到近一倍以上的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果，主要由于4標(biāo)試劑和8標(biāo)試劑在結(jié)構(gòu)上有所差別，導(dǎo)致8標(biāo)試劑在二級(jí)質(zhì)譜中會(huì)產(chǎn)生母離子丟失標(biāo)記試劑的不規(guī)則碎片，難以被常見的搜索引擎解析，對(duì)鑒定性能產(chǎn)生了負(fù)面影響;Ciborowski等［11］對(duì)用4標(biāo)和8標(biāo)iTRAQ 試劑分別標(biāo)記的血漿樣品定量分析，發(fā)現(xiàn)了8標(biāo)的iTRAQ 試劑的定量結(jié)果偏差更小。Yates 等［12］對(duì)TMT 試劑的比較則表明，以6標(biāo)TMT 中任意3標(biāo)分別標(biāo)記兩組樣品各進(jìn)樣一次和以2標(biāo)TMT 標(biāo)記后3次重復(fù)進(jìn)樣相比，兩種方法獲得的有定量信息的蛋白質(zhì)數(shù)目相近，但使用6標(biāo)TMT的樣品中可獲得更多的顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并且縮短了分析時(shí)間。當(dāng)然，基于等重標(biāo)記結(jié)合報(bào)告離子的方法也有著一些缺陷，最大的缺陷是在產(chǎn)生信號(hào)的低質(zhì)量范圍有比較嚴(yán)重的信號(hào)抑制效應(yīng)，影響了定量的動(dòng)態(tài)范圍和準(zhǔn)確度，難以滿足低豐度蛋白質(zhì)的定量要求。此外，由于iTRAQ和TMT 試劑盒價(jià)格昂貴，反應(yīng)步驟復(fù)雜也限制了它們的使用。

圖1 (a)iTRAQ和(b)TMT 試劑的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structures of(a)iTRAQ and(b)TMT

近年來，不斷有更加廉價(jià)易得的等重同位素標(biāo)記試劑被開發(fā)和應(yīng)用。Li 等［13］發(fā)展了一種帶有親和標(biāo)簽的可斷裂等重同位素標(biāo)記試劑CILAT(cleavable isobaric labeled affinity tag)。該試劑由生物素親和標(biāo)簽、酸可裂解鍵、報(bào)告基團(tuán)、平衡基團(tuán)以及巰基反應(yīng)基團(tuán)等部分共同組成。由于酪氨酸可以被酪氨酸酶氧化為鄰醌，得到的鄰醌可以和巰基通過邁克爾加成反應(yīng)將CILAT 標(biāo)記到肽段上，并且還可以利用所引入的親和標(biāo)簽富集含酪氨酸的肽段;另外，酪氨酸在蛋白質(zhì)中的含量(3.35%)遠(yuǎn)高于半胱氨酸(0.99%)，因此這樣的富集還可以提高蛋白質(zhì)鑒定的序列覆蓋度。之后，該課題組［14］又通過對(duì)同位素標(biāo)記基團(tuán)的改進(jìn)，將該標(biāo)記試劑由可對(duì)兩組樣品同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記改進(jìn)到可對(duì)12組樣品同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記。上述的標(biāo)記試劑由于只和酪氨酸氧化后的鄰醌反應(yīng)，對(duì)肽段的定量有一定的偏向性。該課題組［15，16］最近又基于iTRAQ的反應(yīng)基團(tuán)設(shè)計(jì)了一種DiART(deuterium isobaric amine reactive tag)試劑。DiART試劑為6種同一結(jié)構(gòu)的分子，包含報(bào)告基團(tuán)、平衡基團(tuán)和與iTRAQ和TMT 相同的反應(yīng)基團(tuán)NHS。每種DiART 試劑包含4個(gè)2H 原子，置于親水基團(tuán)附近，用于消除2H 原子造成的色譜流出差異效應(yīng)。該試劑的合成步驟僅需6步，最終產(chǎn)率為30%～40%，大大優(yōu)于TMT 試劑的14步合成路線及其低于1%的產(chǎn)率。同時(shí)在試劑中采用2H 原子代替價(jià)格昂貴的13C 或15N 原子也大大降低了成本。他們將DiART 試劑與電噴霧-線性離子阱-傅里葉變換靜電場(chǎng)軌道阱(ESI-LTQ-Orbitrap)結(jié)合，采用碰撞誘導(dǎo)碎裂-高能碰撞碎裂(CID-HCD)方法對(duì)DiART 標(biāo)記的肽段進(jìn)行了高可信度的定性以及高準(zhǔn)確度的定量，同時(shí)采用電子轉(zhuǎn)移裂解-高能碰撞碎裂(ETD-HCD)方法對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行了定性定量分析。Li 等［17］發(fā)展了一種DiLeu(N，N-dimethyl leucine)試劑，該試劑包含能與肽段N 端和賴氨酸ε氨基反應(yīng)的基團(tuán)(三嗪酯)、平衡基團(tuán)和報(bào)告基團(tuán)。DiLeu 標(biāo)記后的肽段比未標(biāo)記的肽段相對(duì)分子質(zhì)量增加145.1 Da，而在串級(jí)質(zhì)譜中可分別產(chǎn)生m/z 115.1、116.1、117.1和118.1的報(bào)告離子。在用于蛋白質(zhì)的酶解樣品時(shí)，DiLeu和iTRAQ 試劑顯示了類似的蛋白質(zhì)序列覆蓋度(～43%)以及定量準(zhǔn)確性(＜15%)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)DiLeu 能夠增強(qiáng)碎裂，為蛋白質(zhì)鑒定和從頭測(cè)序提高可信度。此外，DiLeu 合成所需要的試劑均為市售試劑，合成步驟簡(jiǎn)單，因此相比iTRAQ 試劑，費(fèi)用大大降低。但該試劑的缺點(diǎn)是反應(yīng)基團(tuán)的普適性不夠強(qiáng)，需要比較特殊的反應(yīng)條件才能將標(biāo)簽標(biāo)記于肽段上。Deshaies和Beauchamp 等［18］基于點(diǎn)擊化學(xué)發(fā)展了一種以加州理工學(xué)院命名的等重同位素標(biāo)記試劑CITs(caltech isobaric tags)，通過銅(I)催化的疊氮-炔的環(huán)加成反應(yīng)得到了氣相可裂解的鍵用于產(chǎn)生報(bào)告離子，該試劑在二級(jí)質(zhì)譜的碰撞碎裂過程中會(huì)釋放出穩(wěn)定的陽離子型報(bào)告基團(tuán)，且將報(bào)告離子的質(zhì)量數(shù)分別增加到164和169，可以降低三維離子肼在低質(zhì)量端的cut-off 效應(yīng)。

以上的方法中，一次實(shí)驗(yàn)可定量的樣品數(shù)由定量試劑的報(bào)告離子數(shù)目決定，通常一次實(shí)驗(yàn)中可定量2～8組樣品。對(duì)于更高通量的要求，有研究者將等重同位素標(biāo)記和非等重同位素標(biāo)記進(jìn)行結(jié)合，在一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜上同時(shí)進(jìn)行定量，將一次定量的樣品最多擴(kuò)展到了12組［19］或18組［20］;也有研究者將高精度質(zhì)譜和等重同位素標(biāo)記進(jìn)行結(jié)合，利用高精度質(zhì)譜對(duì)商業(yè)化試劑TMT 報(bào)告離子微小的質(zhì)量差異(～6 mDa)進(jìn)行進(jìn)一步的區(qū)分，將6組標(biāo)記的試劑擴(kuò)展到實(shí)現(xiàn)8組樣品的同時(shí)定量［21］。在蛋白質(zhì)絕對(duì)定量的研究中，也有工作將二級(jí)質(zhì)譜定量的方法和一級(jí)質(zhì)譜定量的方法相結(jié)合，拓展了一次實(shí)驗(yàn)中可定量的樣本數(shù)。我們課題組發(fā)展了“iTRAQ結(jié)合18O”標(biāo)記相對(duì)定量技術(shù)［22］，實(shí)現(xiàn)了4種不同樣品中目標(biāo)糖蛋白的糖基化位點(diǎn)占有率的同時(shí)定量。即首先采用4組iTRAQ 試劑對(duì)4組樣品分別進(jìn)行標(biāo)記(標(biāo)記試劑報(bào)告離子114～117)，然后再任意選取其中2組用H216O 進(jìn)行PNGaseF 去糖鏈處理(114，115標(biāo)記的樣品)，另兩組則在H218O 中進(jìn)行去糖鏈處理(116，117標(biāo)記的樣品)。標(biāo)記后進(jìn)行混合，放大串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的母離子檢測(cè)窗口，iTRAQ 標(biāo)記試劑可在二級(jí)質(zhì)譜中獲得肽段的定量信息，16O 或18O 可在一級(jí)質(zhì)譜中獲得糖基化位點(diǎn)的定量信息，從而實(shí)現(xiàn)4組樣品中糖基化位點(diǎn)程度的定量。

2.1.2 基于亞氨離子定量

肽段中纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸在二級(jí)質(zhì)譜中容易形成亞氨離子(immonium ion)，因此也可以用于發(fā)展成二級(jí)質(zhì)譜定量方法。Quadroni 等［23］將細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(SILAC)和等重標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，通過在纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸的羰基和氨基中分別引入13C 或15N 標(biāo)記(例如在這3種氨基酸殘基中13C=O 對(duì)應(yīng)的是14N，或12C=O 對(duì)應(yīng)的是15N)，由于這3個(gè)氨基酸都只增加1 Da 因此在細(xì)胞培養(yǎng)過程中可實(shí)現(xiàn)等重標(biāo)記。在二級(jí)質(zhì)譜中所形成的亞氨離子RC=NH 中N 原子由于存在輕、重同位素標(biāo)記會(huì)產(chǎn)生1 Da的質(zhì)量差異，這對(duì)亞氨離子的強(qiáng)度分別代表了兩組樣品中肽段的強(qiáng)度，從而可以實(shí)現(xiàn)二級(jí)質(zhì)譜中的定量。

2.1.3 基于互補(bǔ)離子定量

基于二級(jí)質(zhì)譜報(bào)告離子定量的技術(shù)在質(zhì)譜提取母離子進(jìn)行碎裂時(shí)，往往同時(shí)會(huì)引入其他色譜共流出相中相近質(zhì)量數(shù)的干擾肽段，這些肽段在二級(jí)質(zhì)譜中也會(huì)產(chǎn)生相同的報(bào)告離子，從而對(duì)目標(biāo)肽段的定量準(zhǔn)確性造成一定的影響。如果能使用帶有肽段特征性信息的離子進(jìn)行定量，則有助于提高定量的準(zhǔn)確度。Gygi 等［24］最近報(bào)道了一種基于TMT 試劑標(biāo)記的新型二級(jí)質(zhì)譜定量方法，不同于常規(guī)的利用TMT的低質(zhì)量端報(bào)告離子定量，他們使用的是TMTC(complement TMT fragment ion)離子用于定量。二級(jí)質(zhì)譜用HCD 進(jìn)行裂解時(shí)，TMT 標(biāo)記的肽段碎裂產(chǎn)生報(bào)告離子后剩下的部分被稱為TMTC離子，這樣的TMTC離子與低質(zhì)量端的報(bào)告離子具有等效的定量信息并帶有肽段特征性信息。如圖2所示，在一級(jí)質(zhì)譜圖中，干擾離子(藍(lán)色)與目標(biāo)離子(紅色)同在分離窗口中，同時(shí)被選擇裂解，若選擇報(bào)告離子用于定量，由于干擾離子同樣具有報(bào)告離子會(huì)造成定量的不準(zhǔn)確，而使用互補(bǔ)的TMTC離子用于定量時(shí)由于TMTC離子的位置取決于目標(biāo)肽段的質(zhì)量與電荷數(shù)，去除了干擾離子的干擾，使得定量更加準(zhǔn)確。他們將酵母酶解肽段以不同TMT 標(biāo)記后按照一定比例混合作為目標(biāo)肽段，TMT 標(biāo)記的人源肽段作為干擾肽段，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確定量。目前，TMTC最大的問題還是如何有效產(chǎn)生TMTC的標(biāo)簽用于定量，產(chǎn)生TMTC的效率取決于肽段的序列和電荷狀態(tài)，還需要更深入的研究其規(guī)律性或者對(duì)TMT 試劑加以改進(jìn)以保證產(chǎn)生盡可能多的TMTC離子。另外，由于TMT-129和TMT-130標(biāo)記的肽段產(chǎn)生的TMTC質(zhì)量數(shù)相同，在質(zhì)譜中難以分辨，因此只能實(shí)現(xiàn)5組樣品的定量。該課題組還開展了三級(jí)質(zhì)譜定量的方法來消除色譜共洗脫質(zhì)量數(shù)相近離子造成的定量誤差［25］。樣品經(jīng)過Lys-C 酶解之后，生成的肽段在C-末端(K)和N-末端都帶有氨基基團(tuán)，與TMT 試劑反應(yīng)會(huì)生成兩端都帶有TMT 標(biāo)簽的肽段。當(dāng)母離子被提取進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜碎裂分析后，強(qiáng)度最強(qiáng)的碎片離子將進(jìn)一步被提取進(jìn)行三級(jí)質(zhì)譜的碎裂。由于任意b、y 離子都含有TMT 標(biāo)簽，所以能夠在三級(jí)質(zhì)譜碎裂的過程中實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)肽段的相對(duì)定量。這一方法有效地消除了干擾肽段造成的定量誤差，提高了定量的準(zhǔn)確性。然而，基于三級(jí)質(zhì)譜定量只是提高了TMT 所標(biāo)記肽段本身的定量準(zhǔn)確性，而一條肽段仍然只有一個(gè)定量信息，定量的隨機(jī)誤差不能避免。另外，由于需要在肽段兩端都帶上標(biāo)記試劑，因此須采用Lys-C 酶切，這在一定程度上會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的鑒定率和定量率降低;額外的三級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集也使得質(zhì)譜分析流程更加復(fù)雜和耗時(shí)。

圖2 互補(bǔ)離子(TMTC)定量方法的原理示意圖Fig.2 Principle of interference-free quantification based on the TMTC cluster

2.2 基于多對(duì)離子定量

二級(jí)質(zhì)譜過程中，產(chǎn)量最豐富的離子莫過于用于蛋白質(zhì)鑒定的多對(duì)b、y 離子，如果這些離子對(duì)也帶上質(zhì)量標(biāo)簽，就可以被用于反映肽段量的變化。從單個(gè)離子代表一條肽段的定量信息發(fā)展為由多對(duì)離子反映一條肽段的定量信息，這樣的改進(jìn)提高了蛋白質(zhì)的定量。多對(duì)離子定量方法的核心在于對(duì)肽段的C-末端和N-末端采用質(zhì)量互補(bǔ)的同位素試劑標(biāo)記產(chǎn)生等重標(biāo)記的肽段，使得來源于不同樣品的同一條肽段在一級(jí)質(zhì)譜中質(zhì)量數(shù)相同，在二級(jí)質(zhì)譜中則產(chǎn)生成對(duì)的b、y 離子對(duì)用于肽段的定量和鑒定。這樣的定量方法集合了開大窗口二級(jí)質(zhì)譜定量和等重標(biāo)記之報(bào)告離子二級(jí)質(zhì)譜定量的優(yōu)點(diǎn)，即通過等重標(biāo)記無需開大窗口就可以實(shí)現(xiàn)不同標(biāo)記肽段串級(jí)質(zhì)譜共碎裂，且二級(jí)譜圖中多對(duì)b、y 離子對(duì)用于肽段的定量有效降低了定量的隨機(jī)誤差，提高了定量的準(zhǔn)確性。根據(jù)對(duì)肽段N-末端和C-末端引入標(biāo)記的方法不同，目前的方法可以分為如下幾類。

2.2.1 化學(xué)標(biāo)記引入等重同位素標(biāo)簽

最早的等重標(biāo)記b、y 離子對(duì)二級(jí)質(zhì)譜定量是Thiede 等［26］發(fā)展的IPTL(isobaric peptide termini labeling)方法，是基于兩步化學(xué)標(biāo)記反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)肽段的等重標(biāo)記。在Lys-C 酶解得到肽段后，分別在兩組樣品1和2中加入2-甲氧基-4，5-二氫-1H-咪唑(MDHI)-d4(重型)和MDHI(輕型)進(jìn)行肽段C-末端標(biāo)記反應(yīng)，然后再加入琥珀酸酐(SA)(輕型)和SA-d4(重型)進(jìn)行肽段N-末端標(biāo)記反應(yīng)，經(jīng)過標(biāo)記后不同樣品中相同肽段實(shí)現(xiàn)了等重標(biāo)記。該課題組［27］隨后改變標(biāo)記基團(tuán)發(fā)展了另一種類似原理的標(biāo)記方法，即Lys-C 酶解產(chǎn)生的肽段先進(jìn)行N-末端SA(輕型)和SA-d4(重型)標(biāo)記，然后分別進(jìn)行肽段C-末端的重型和輕型二甲基化標(biāo)記，使得標(biāo)記流程更簡(jiǎn)單快捷，易于操作。Zou 等［28］則通過位點(diǎn)特異性反應(yīng)分別在N-末端和C-末端引入標(biāo)記，即首先在酸性條件下對(duì)N-末端進(jìn)行二甲基化標(biāo)記，然后將pH 調(diào)節(jié)至近中性，再實(shí)現(xiàn)C-末端賴氨酸上的二甲基化，兩組樣品即可通過調(diào)節(jié)二甲基化反應(yīng)中的同位素組成實(shí)現(xiàn)等重標(biāo)記。由于采用的是體外的化學(xué)標(biāo)記，因此適用于多種樣品來源(細(xì)胞、組織、體液等)的定量分析。但這類定量方法最大的缺陷在于，它們都采用了Lys-C 酶解以便產(chǎn)生以賴氨酸結(jié)尾的肽段用于C-末端的標(biāo)記，與廣泛使用的胰蛋白酶(trypsin)相比產(chǎn)生的肽段較長(zhǎng)且?guī)Ф嚯姾?，Lys-C產(chǎn)生的肽段相對(duì)不利于基于碰撞誘導(dǎo)碎裂(CID)的質(zhì)譜檢測(cè)，導(dǎo)致肽段鑒定的效率降低;另外，含有賴氨酸漏切位點(diǎn)的肽段由于不能實(shí)現(xiàn)等重標(biāo)記，不能用于b、y 離子對(duì)的二級(jí)質(zhì)譜定量，導(dǎo)致了部分肽段定量信息的丟失。在最近的工作中，Thiede 等［29］將位點(diǎn)特異性反應(yīng)和二甲基化同位素標(biāo)記進(jìn)行組合，在輕、重標(biāo)記之間引入一組中等質(zhì)量數(shù)標(biāo)簽，并且這組中等質(zhì)量數(shù)標(biāo)簽使得肽段兩端標(biāo)記后的質(zhì)量數(shù)增加和輕、重兩組標(biāo)記后的質(zhì)量數(shù)增加一致，這樣3組樣品標(biāo)記后在一級(jí)質(zhì)譜上仍然只呈現(xiàn)一組峰，但在二級(jí)質(zhì)譜中則呈現(xiàn)輕、中和重標(biāo)記的成對(duì)b、y 離子，從而將等重標(biāo)記b、y 離子定量的方法擴(kuò)展到了3組。

2.2.2 代謝標(biāo)記引入等重同位素標(biāo)簽

除了利用化學(xué)反應(yīng)引入標(biāo)記之外，選取合適的氨基酸加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)也可以引入等重標(biāo)記，我們課題組［30］發(fā)展了一種新型的大規(guī)模的蛋白質(zhì)標(biāo)記定量方法，即體內(nèi)終端氨基酸代謝標(biāo)記(in vivo termini amino acid labeling，IVTAL)結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜定量的策略。如圖3所示，該方法的核心是通過一組重同位素標(biāo)記的精氨酸(13C6-R)和賴氨酸(13C6-K)分別進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)以及后續(xù)的特異性內(nèi)切蛋白酶Lys-N和Arg-C的順序酶解，得到以賴氨酸(K)開頭和精氨酸(R)結(jié)尾的肽段，這些肽段在一級(jí)質(zhì)譜中產(chǎn)生相同的母離子質(zhì)量，但是在二級(jí)質(zhì)譜的整個(gè)質(zhì)量范圍內(nèi)可以產(chǎn)生具有6 Da 質(zhì)量差異的b、y 碎片離子對(duì)，提取這些碎片離子對(duì)的峰強(qiáng)度可以用來定量相應(yīng)的肽段和蛋白。同樣由于是采用多對(duì)b、y 碎片離子對(duì)定量一條肽段，定量的隨機(jī)誤差被降低，因此IVTAL 方法保證了肽段定量的準(zhǔn)確度。另外，由于IVTAL 方法中同位素的引入和樣品的混合是在實(shí)驗(yàn)的早期，與SILAC 相似，實(shí)驗(yàn)誤差被最小化。但這種方法主要適用于細(xì)胞來源樣品的蛋白質(zhì)的定量分析，并且需要使用Lys-N和Arg-C進(jìn)行酶解。

圖3 體內(nèi)終端氨基酸標(biāo)記定量方法的流程圖Fig.3 Schematic of in vivo termini amino acid labeling strategy(IVTAL)

2.2.3 化學(xué)標(biāo)記和酶促標(biāo)記組合引入等重同位素標(biāo)簽

我們課題組發(fā)展了一種化學(xué)標(biāo)記和酶促標(biāo)記結(jié)合的標(biāo)記方法［31］。概括來說，兩組對(duì)照樣品的trypsin 酶解肽段分別在H216O 或H218O 水中進(jìn)行trypsin催化的標(biāo)記反應(yīng)，所有以賴氨酸和精氨酸結(jié)尾的酶解肽段的C-末端都會(huì)被分別標(biāo)記上兩個(gè)16O 或18O原子，產(chǎn)生4 Da的差異。標(biāo)記肽段經(jīng)胍基化修飾后(目的是為了封閉側(cè)鏈的氨基使其在下一步的二甲基化標(biāo)記中不被標(biāo)記)，分別進(jìn)行二甲基化標(biāo)記，其中16O 標(biāo)記的樣品與氘代甲醛(CD2O)反應(yīng)，18O 標(biāo)記的樣品與甲醛(CH2O)反應(yīng)，這樣兩組樣品中的相同肽段實(shí)現(xiàn)了等重標(biāo)記，并且等重標(biāo)記肽段進(jìn)行反相色譜(RPLC)分離時(shí)同位素效應(yīng)幾乎可以忽略。該方法應(yīng)用于鼠肝樣品的定量蛋白質(zhì)組分析結(jié)果表明，對(duì)于復(fù)雜樣品，該方法具有很好的定量準(zhǔn)確性。并且由于是胰酶進(jìn)行的酶切，可定量的肽段比采用Lys-C 酶切的樣品提高了近一倍，使得鑒定到的蛋白質(zhì)中有84%的蛋白質(zhì)有定量信息，而IVTAL和IPTL 方法僅有47%和42%鑒定的蛋白質(zhì)有定量信息。

2.2.4 其他

針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)組的定量，Aebersold 等［32］建立了一種名為索引離子引發(fā)的二級(jí)質(zhì)譜離子定量方法iMSTIQ(index-ion triggered MS2 ion quantification)。肽段用mTRAQ 試劑(Applied Biosystems)的+4Da的形式進(jìn)行同位素標(biāo)記，并合成了對(duì)應(yīng)的在C 端R(+4 Da)和K(+8 Da)重標(biāo)的目標(biāo)樣品肽段。合成的目標(biāo)肽段中:一部分用mTRAQ的+0 Da的形式進(jìn)行同位素標(biāo)記作為參比肽段，該肽段與樣品肽段mTRAQ的+4 Da 是等重的;另一部分用mTRAQ的+4 Da 或+8 Da的形式進(jìn)行同位素標(biāo)記作為“索引”肽段。目標(biāo)肽段的樣品肽段、參比肽段、索引肽段3種不同形式的化學(xué)性質(zhì)相同，在LC 分析中可以共洗脫，在一級(jí)質(zhì)譜分析中，樣品和參比肽段均與索引肽段產(chǎn)生+8 Da的質(zhì)量差異，通過索引肽段(加入時(shí)的含量較高)的檢測(cè)引發(fā)目標(biāo)樣品、參比肽段的CID 過程，進(jìn)而利用二級(jí)質(zhì)譜中樣品、參比肽段的多對(duì)b、y 離子相對(duì)強(qiáng)度的測(cè)定進(jìn)行目標(biāo)樣品的定量分析。該方法的主要優(yōu)勢(shì)包括:1)通過含量較高的索引離子的檢測(cè)引發(fā)目標(biāo)肽段二級(jí)譜圖的獲得，不需要考慮目標(biāo)肽段的離子強(qiáng)度。與基于inclusion list的目標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)方法相比較，提高了靈敏度和準(zhǔn)確性，對(duì)于復(fù)雜生物樣品中低豐度目標(biāo)肽段的定量分析具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。2)與基于SRM的目標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)方法相比較，無需預(yù)先選定最佳transition。3)利用二級(jí)質(zhì)譜中多對(duì)特異性碎裂離子強(qiáng)度比進(jìn)行定量，也增加了定量的準(zhǔn)確性。但也由于索引肽段是針對(duì)目標(biāo)肽段而合成的，所以這種方法不適合于大規(guī)模的蛋白質(zhì)組定量。

3 多級(jí)質(zhì)譜定量的發(fā)展趨勢(shì)

大規(guī)模蛋白質(zhì)組的相對(duì)定量需要更高準(zhǔn)確度、更高精度、更高靈敏度和更高通量的新方法。多級(jí)質(zhì)譜定量也正朝著這些目標(biāo)努力。對(duì)于更高準(zhǔn)確度的要求，有研究者將前體離子氣相純化技術(shù)和等重同位素標(biāo)記相結(jié)合，通過質(zhì)子轉(zhuǎn)移離子-離子反應(yīng)對(duì)前體離子先進(jìn)行去卷積得到低電荷價(jià)態(tài)的相應(yīng)離子再經(jīng)過離子選擇和碎裂，有效地排除了共洗脫相近質(zhì)量數(shù)離子的干擾［33，34］。對(duì)于更高靈敏度的要求，則需要和多種蛋白質(zhì)富集技術(shù)相結(jié)合，這就對(duì)富集技術(shù)的效率提出了更高的要求，要保證盡可能無偏向性、高回收率、高重復(fù)性地從復(fù)雜樣品中富集到低豐度的蛋白質(zhì)用于定量。對(duì)于翻譯后修飾蛋白質(zhì)組的定量而言，蛋白質(zhì)水平的定量和修飾程度的定量都同樣重要，等重標(biāo)記的二級(jí)質(zhì)譜b、y 離子定量的特點(diǎn)對(duì)于具有后修飾的蛋白質(zhì)定量(尤其是富含多種后修飾類型和后修飾位點(diǎn)的肽段)可能會(huì)顯現(xiàn)更大的優(yōu)勢(shì)，即產(chǎn)生的大量b、y 碎片離子可以對(duì)修飾位點(diǎn)進(jìn)行具體的確認(rèn)和對(duì)修飾程度進(jìn)行定量，將克服一個(gè)肽段的強(qiáng)度包含了所有后修飾位點(diǎn)的變化情況的缺點(diǎn)。最后，對(duì)于這些新發(fā)展的蛋白質(zhì)組多級(jí)質(zhì)譜定量方法，還需要開發(fā)相應(yīng)的生物信息學(xué)軟件為所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行更加準(zhǔn)確的解析。相信定量技術(shù)的不斷發(fā)展會(huì)給大規(guī)模的差異蛋白質(zhì)組研究提供更先進(jìn)的研究策略，幫助科學(xué)家挖掘出更多重要的差異蛋白質(zhì)。

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