大鼠心室肌細胞的分離及其單通道鈣電流的記錄

田力，白雨軒，田宏

（喀喇沁旗醫(yī)院，內(nèi)蒙古赤峰024000）

大鼠心室肌細胞的分離及其單通道鈣電流的記錄

田力，白雨軒，田宏

（喀喇沁旗醫(yī)院，內(nèi)蒙古赤峰024000）

采用Langendorff灌流、Worthington膠原酶法分離大鼠心室肌細胞，應(yīng)用膜片鉗制技術(shù)單通道模式記錄大鼠心室肌細胞的鈣電流，并進行膜片鉗電生理學(xué)研究.

心室肌細胞；膜片鉗；單通道；鈣電流記錄

細胞的電活動是生命活動的基礎(chǔ)，而這些電活動則是通過細胞膜離子通道而實現(xiàn)的[1]，離子通道的基本功能是通過維持離子的跨膜運動，產(chǎn)生生物電現(xiàn)象而完成的.因此研究膜離子通道的通透機制及各種離子通透性的變化對闡明細胞生物電現(xiàn)象和其他生命現(xiàn)象的機制具有重要的理論意義和應(yīng)用價值[2].德國生理學(xué)家Neher和Sakmann（1976）[3]首次報道了在單個蛙骨骼纖維上，用他們獨創(chuàng)的膜片鉗制技術(shù)，記錄到單通道電流.后來經(jīng)過他們對該技術(shù)的改進（Hamill等1981）[1]，該技術(shù)可應(yīng)用于各種細胞的離子流研究，他們的成就獲得了（1991年）生理學(xué)諾貝爾獎.

膜片鉗技術(shù)一直是研究離子通道的主要技術(shù)，它使得我們能夠在單個的細胞上觀察單個的離子通道電活動，對離子通道的認識向前跨進到了分子水平[4].目前，膜片鉗技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生理、生物、藥理學(xué)等生命研究領(lǐng)域，對其發(fā)展起到了重要的作用.心臟的電學(xué)活動一直被人們所關(guān)注，單個心肌細胞分離的成功，以及這一技術(shù)的推廣，為在單個心肌細胞上進行研究提供了條件.因此本研究在以往方法的基礎(chǔ)上對大鼠心室肌細胞分離方法進行摸索和完善，并記錄觀察了所獲細胞的鈣電流單通道記錄.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性Wistar大鼠，體重300～500g.

1.1.2 主要試劑

KOH，NaH2PO4，KHPO4，NaCl，KCl，MgCl2，CaCl2，NaOH，Glucose和Taurine均為國產(chǎn)市售分析純試劑，Glutamicacid和HEPES購自Amresco公司，EGTA購自日本DOJINDO公司，Protease購自sigma公司，Worthington膠原酶購自worthington biochemicalcorporation.

1.1.3 主要儀器

（2）造成系統(tǒng)電壓發(fā)生閃變。對于分布式電源而言，其啟停均會受到一系列因素（如用戶實際用電量等）的影響，即具有很高的不確定性，如此一來，也就加大了系統(tǒng)電壓閃變的幾率和影響。除此之外，當分布式電源提供的輸出量發(fā)生瞬間突變時，也將會引發(fā)系統(tǒng)電壓閃變的問題。

Langendorff灌流裝置，恒溫水浴鍋，小動物呼吸機，量筒，燒杯.

1.1.4 單通道膜片鉗技術(shù)記錄鈣電流

1.1.4.1 儀器：倒置顯微鏡(Olympus)、Axopatch200B放大器(Axon公司)、數(shù)模轉(zhuǎn)換器(Axon公司)、微電極拉制儀(Sutter公司)、pClamp10軟件等.

1.1.4.2 試劑:灌流液為基礎(chǔ)細胞內(nèi)液(mM):Aspartic acid100,KOH100,KCl30,MgCl20.5,EGTA1,Ca-Cl20.5,HEPES-KOH10，pH7.4.電極內(nèi)液組成(mM)：BaCl250,tetrathylammoniumchloride70,EGTA0.5,BayK86440.003,Hepes-CsOHbuffer10, pH7.4.

1.2 方法

1.2.1 大鼠心室肌細胞的分離

大鼠心室肌細胞的分離：采用大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉110mg/Kg進行麻醉，置仰臥位固定，實行氣管插管，末端接連小動物呼吸機，然后打開胸腔，使心臟和主動脈暴露于體外，再進行主動脈插管，最后將游離的心臟置于Langendorff裝置進行主動脈逆行灌流.先用含鈣臺式液灌流約3min，再用無鈣臺式液灌流約6min，然后再用膠原酶消化40min左右，最后用KB液沖洗殘酶約5min.整個灌流系統(tǒng)用恒溫水浴保持在37℃，所有液體均用純氧飽和后再進行試驗.灌流完畢后，取下心臟，放入室溫的KB液中機械分離細胞，得到單個細胞懸液.經(jīng)105μm的鋼絲膜過濾后，置于含有蛋白酶的KB液中37℃水浴均勻震蕩4min.離心3次(1000r/min)去除殘留酶，最后置于4℃的KB液靜置1h后進行實驗.

取細胞懸液滴加入到顯微鏡灌流浴槽中，待細胞沉底后用IO液進行灌流，采用膜片鉗細胞貼附和膜內(nèi)向外兩種記錄細胞膜L型鈣通道的單通道電流，保持電位-70mV去極至0mV引出電流，波寬200ms，刺激頻率0.5Hz，經(jīng)由膜片鉗放大器進行記錄后，以3.3kHz的采集速度將數(shù)據(jù)輸入計算機.用pClamp10.0軟件記錄數(shù)據(jù)并以pClamp分析軟件進行分析.

2 結(jié)果

2.1 大鼠心室肌細胞的分離

經(jīng)上述方法分離后，得到存活的單個心室肌細胞達40%～50%；高倍鏡下可見，存活細胞形態(tài)良好，呈桿狀或柱狀，具有清晰的橫紋肌.

圖1 分離的大鼠心室肌細胞

圖2 大鼠心室肌細胞鈣電流單通道記錄

圖3 鈣通道關(guān)閉時間分布普通直方圖：τc=78.94ms

3 討論

3.1 心肌細胞的分離是整個實驗的重要基礎(chǔ)，膜片鉗實驗要求細胞標本具有呼吸活性、耐鈣、細胞膜完整、平滑、清潔度高的條件，以利于微電極與細胞膜進行高阻封接.心肌細胞分離有四個重要的因素，分別是手術(shù)的把握、灌流液的溫度以及pH值、水質(zhì)、膠原酶的用量及時間等.

3.2 鈣通道普遍存在于機體的各種組織和細胞，其功能主要是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子濃度[8].細胞內(nèi)的游離鈣離子對組織和細胞的各種生理活動具有廣泛地調(diào)控作用，是及其重要的第二信使.鈣離子對細胞功能和生理反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用是通過鈣信號系統(tǒng)來完成的，該系統(tǒng)幾乎參與了肌肉收縮、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、基因表達等所有的生理過程.

3.3 心肌細胞的單通道的研究工作，修正了早期對離子流閘門（激活與失活）活動的認識，證實了一些以往只能從理論上進行的推測.更為重要的是，在應(yīng)用這種技術(shù)后，不斷的發(fā)現(xiàn)了一些新的離子流和離子通道.

4 結(jié)論

4.1 采用Langendorff灌流，Worthington膠原酶法分離并得到了大鼠心室肌細胞,細胞存活形態(tài)良好.應(yīng)用膜片鉗制技術(shù)單通道模式記錄并得到了大鼠心室肌細胞的鈣電流.

4.2 本實驗項目為基礎(chǔ)實驗研究，可作為Inside out等相關(guān)科研實驗的前期工作.

4.3 心肌細胞鈣離子電流的變化在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要作用，其重要性已經(jīng)受到人們越來越多的重視，對鈣通道的生理功能、特性及其作用藥物的方面的研究也將在心血管系統(tǒng)疾病及其他系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用.

〔1〕HamillO,MartyA,NeherEetal.Improved patch-clamptechniquesforhigh-resolution currentrecordingfromcellsandcell-free membranepatches.PflugersArch,1981;391(1):85.

〔2〕WeidmannS.Themicroelectrodeandthe heart1950-1970.InKaoFF,KoizumK, VassaleM(eds).ResearchinPhysiology[M]. AuloCaggiPublisher,Bolognal.19713-25.

〔3〕NeherE,SakmannB.Singlechannelcurrents recordedfrommembraneofdenervatedfrog musclefibers.Nature,1976,260:799-802.

〔4〕趙衛(wèi)紅,吳宇澄,王笑云,等.耐鈣心肌細胞的分離及其L型鈣通道電流觀察[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2003,23(1):21-23.

〔5〕ZhangJ.SongJ.WuDM．Analysisofemergentisolationmethodforcardiacmyoeytesin patchclampstudies[J].ChinJlntegrMedCardio一CerebrovDis，2008，6(10)1238-9.

〔6〕HintzKK,NorbyFI,DuanJH,eta1.Comparisonofcardiacexcitationcontractioncouplinginimlatedventricularmyocytesbetween ratandmouse.CompBioehemandPhysiol, 2002,133(1):191.

〔7〕ShangLJ,ZangYM,WangSW.Isolation ofcalcium-tolerantsinglemyocardialcellsand itselectrophysiologicalproperties[J].FourthMil MedUniv,2000,21(2):247-9.

〔8〕YangXiangjun,HuiJie,JiangTingbo,Song Jianping,LiuZhihua.Characteristicsofsingle Ca2+channelkineticsinfelinehypertrophied ventricularmyocytesandJIANGWenping. ChineseMedicalJournal2002;115(4):502-508.

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1673-260X（2013）06-0105-02