酶聯(lián)免疫法檢測進(jìn)出口肉制品中的萊克多巴胺

柴銘駿，惠洪文，黃晨

（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心，天津 300461；2.內(nèi)蒙古滿洲里出入境檢驗(yàn)檢疫局，內(nèi)蒙古 滿洲里 021008）

萊克多巴胺是一種苯基乙醇胺類藥物，屬于β-腎上腺素興奮劑，作為“瘦肉精”的替代品它能改變養(yǎng)分的代謝途徑，促進(jìn)動(dòng)物肌肉生長，促進(jìn)動(dòng)物體蛋白質(zhì)沉積，特別是骨骼肌中蛋白質(zhì)的合成，抑制脂肪的合成和積累，從而改善胴體品質(zhì)，使生長速度加快[1-2]。但是，人類食用了殘留有萊克多巴胺的食品動(dòng)物后，會(huì)出現(xiàn)不同程度的中毒現(xiàn)象。我國農(nóng)業(yè)部已在176 號(hào)公告《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用的藥物品種目錄》中將其列入了禁用清單。在歐盟等國家，萊克多巴胺已被禁止用作飼料添加劑。

目前關(guān)于萊克多巴胺的檢測，最通用的方法是使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對樣品進(jìn)行初篩，再用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）進(jìn)行確證[3]。ELISA法利用抗原抗體反應(yīng)原理對目標(biāo)物進(jìn)行測定具有快速、靈敏和高通量等特點(diǎn)，且無需昂貴的儀器，是目前檢測部門應(yīng)用的主要方法[4-6]。本文根據(jù)試際檢測經(jīng)驗(yàn)和數(shù)理統(tǒng)計(jì)原理對萊克多巴胺殘留快速檢測試劑的選用以及運(yùn)用綜合檢測技術(shù)手段加強(qiáng)進(jìn)出口檢驗(yàn)把關(guān)等有關(guān)問題進(jìn)行了探討。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

12043 萊克多巴胺試劑盒：R-Biopharm；3K30 離心機(jī)：SIGMA；ELX800UV 酶標(biāo)儀：BIO-TEK；API 4000液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀：Applied Biosystem；SE812 氮吹儀：Organomation。

乙酸乙酯、乙腈等試劑均為色譜純。試驗(yàn)中所用的肉、肝臟等樣品均為天津口岸進(jìn)出口的試際樣品。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

取3 g 均質(zhì)后樣品于螺紋離心管中，加入8 mL 乙腈和1 mL 乙酸乙酯，漩渦混合器充分混合，振蕩30 min（回旋振蕩）。離心：10 min/4 000 g/20 ℃～25 ℃，取4 mL上清液（相當(dāng)于1 g 樣品）于新離心管中，在60 ℃條件下蒸干。殘留物溶于2mL正己烷（或正庚烷），加入1mL 樣品緩沖液，漩渦混合器混合30 s。離心：10 min/4 000g/20℃～25℃，小心收集下層液體，待ELISA 檢測。

1.2.2 酶聯(lián)免疫測定

測定在室溫20 ℃～25 ℃條件下操作，測定之前將試劑盒以及所有試劑在室溫（20 ℃～25 ℃）下放置1 h～2 h。加入100 μL 稀釋后的抗體溶液到微孔底部，在室溫（20 ℃～25 ℃）下孵育15 min，倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每輪拍打3 次）以保證完全除去孔中的液體。用250 μL 洗滌緩沖液充入孔中，再次倒掉微孔中液體，重復(fù)操作2 次。加入20 μL 的標(biāo)準(zhǔn)品或按1.2.1 處理的樣品溶液到各自的微孔中。然后加入100 μL 稀釋后的酶標(biāo)記物到微孔底部，小心充分混合，室溫（20 ℃～25 ℃）下孵育30 min。倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每輪拍打3 次）以保證完全除去孔中的液體。用250 μL 洗滌緩沖液充入孔中，再次倒掉微孔中液體，再重復(fù)操作兩次。加入100 μL 底物/發(fā)色試劑到微孔中，小心充分混合并在室溫（20 ℃～25 ℃）下暗處孵育15 min。加入100 μL 反應(yīng)終止液到微孔中?；旌虾迷?50 nm 處測量吸光度值。

1.3 結(jié)果計(jì)算

按下式計(jì)算百分吸光度值：

式中：B 為標(biāo)準(zhǔn)溶液或供試樣品的平均吸光度值；BO零標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液平均吸光度值；以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以百分吸光度值為縱坐標(biāo)繪制半對數(shù)曲線。

1.4 陽性確認(rèn)試驗(yàn)

對于ELISA 陽性的樣品（ELISA 測定大于0.5 μg/kg），按照進(jìn)出口動(dòng)物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1924-2011《進(jìn)出口動(dòng)物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》的方法進(jìn)行樣品前處理，以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）進(jìn)行確證。色譜柱為MG C18柱（100 mm×2.1 mm，5 μm），流動(dòng)相A 為0.1%的甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈，梯度洗脫程序?yàn)椋? min～7 min，流動(dòng)相A 由90 %降至25 %，7.01 min，流動(dòng)相A 升至90%，保持7min。質(zhì)譜以正離子模式掃描，采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式檢測，定量離子對為302.3/164.2，定性離子對為302.3/284.3。方法檢出限為0.1μg/kg。

2 結(jié)果與討論

2.1 重復(fù)性試驗(yàn)

選用不同批號(hào)的試劑盒，做10 次標(biāo)準(zhǔn)曲線，每次試驗(yàn)均做平行試驗(yàn)。典型的ELISA 試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

10 次標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50值在0.728 μg/kg～0.934 μg/kg之間，CV 值為5.67%，每次平行標(biāo)準(zhǔn)品間的CV 值在0.3%～7.8%之間，均＜10%。

2.2 回收率和精密度試驗(yàn)

取若干空白豬肝、豬肉樣品，分別添加萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加終濃度為0.5 μg/kg、1.0 μg/kg，每種濃度6 個(gè)平行，測定3 批。計(jì)算測定含量（平均值）、添加回收率及批內(nèi)與批間變異系數(shù)。見表1 和表2。

表1 豬肉樣品準(zhǔn)確度和精密度測定結(jié)果Table 1 Test results of pork sample accuracy and precision

表2 豬肝樣品準(zhǔn)確度和精密度測定結(jié)果Table 2 Test results of pork liver sample accuracy and precision

測定結(jié)果表明豬肉樣品添加濃度的回收率81.5 %～92.4%、批內(nèi)變異系數(shù)3.65%～8.43%、批間變異系數(shù)分別為10.42%和9.43%；豬肝樣品添加濃度的回收率75.6%～86.7%、批內(nèi)變異系數(shù)4.54%～9.87%、批間變異系數(shù)分別為7.84%和9.18%。

2.3 確認(rèn)試驗(yàn)

采用HPLC-MS/MS 方法對陽性樣品進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Verification of the test results μg/kg

從表3 可以看出ELISA 法初篩后為陽性的樣品，經(jīng)LC-MS/MS 法測定后，ELISA 結(jié)果總是高于LC-MS/MS 法測定結(jié)果。推測原因可能為，萊克多巴胺在動(dòng)物體內(nèi)的代謝速度較快，動(dòng)物在停藥3 天以后一部分萊克多巴胺就以代謝物的形式存在了，其主要代謝物為萊克多巴胺葡萄糖苷酸；萊克多巴胺葡萄糖苷酸根據(jù)代謝位點(diǎn)的不同，分為萊克多巴胺葡萄糖苷酸A、萊克多巴胺葡萄糖苷酸B 和萊克多巴胺葡萄糖苷酸C[7]。文獻(xiàn)提供的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，萊克多巴胺抗體對萊克多巴胺的代謝物存在交叉反應(yīng)，尤其對萊克多巴胺葡萄糖苷酸C 的交叉反應(yīng)性非常高。萊克多巴胺初篩檢測中所采用的ELISA 試劑盒生產(chǎn)商提供的數(shù)據(jù)表明：該抗體對三種不同代謝物的交叉反應(yīng)率均較高?；诳贵w反應(yīng)的ELISA 初篩檢測方法可以檢出動(dòng)物肉產(chǎn)品中的萊克多巴胺原藥與代謝物成分，而HPLC-MS/MS只能檢測出樣品中的萊克多巴胺原藥含量，因此目前ELISA 初篩檢測法的結(jié)果總是高于HPLC-MS/MS 法，且在代謝物未完全排出之前，隨著停藥期的延長，這種差別愈加顯著。

3 結(jié)論

本文采用ELISA 法篩選，LC-MS/MS 法進(jìn)行確證，可以很好的檢測進(jìn)出口肉制品中萊克多巴胺的殘留。在實(shí)際中由于萊克多巴胺的特殊性，ELISA 方法與儀器法并不能完全符合。為避免漏檢的發(fā)生，建議采取以下措施：

1）完善液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，使其能檢測萊克多巴胺代謝物。

2）針對進(jìn)境肉制品中萊克多巴胺用藥量較大，檢出含量較高的情況，應(yīng)將其列為重點(diǎn)監(jiān)控對象。

總之，在進(jìn)行萊克多巴胺的檢測時(shí)要注意其檢測的特殊性，確保檢測結(jié)果的正確性，保證執(zhí)法的公正性。

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