雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞侵襲性抑制的體外研究

李建斌翟玉平祝新根呂世剛劉峰程祖玨★

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雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞侵襲性抑制的體外研究

李建斌1翟玉平2祝新根1呂世剛1劉峰1程祖玨1★

目的研究雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide）對(duì)體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞侵襲性的抑制作用，并探討其作用分子機(jī)制。方法使用MTT法檢測雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖抑制作用，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測雷公藤內(nèi)酯醇處理后細(xì)胞侵襲能力的變化，進(jìn)一步通過Real-Time PCR和Western印跡法檢測雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的組織蛋白酶 B（Cathepsins B，CB）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）表達(dá)的影響。結(jié)果雷公藤內(nèi)酯醇以劑量-效應(yīng)方式抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)可減弱U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力，下調(diào)其CB、MMP-9表達(dá)水平。結(jié)論在體外實(shí)驗(yàn)中雷公藤內(nèi)酯醇抑制U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長的機(jī)制與下調(diào)CB及MMP-9的表達(dá)，降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞水解細(xì)胞外基質(zhì)的能力有關(guān)。

雷公藤內(nèi)酯醇；膠質(zhì)瘤；侵襲

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最主要的顱內(nèi)惡性腫瘤，約占44.6%[1～2]，其侵襲性生長的特性是神經(jīng)膠質(zhì)瘤手術(shù)難以全切，預(yù)后不良的重要原因。雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide）是從傳統(tǒng)中草藥雷公藤中提取的二萜類單體，生物學(xué)作用廣泛，對(duì)肺癌、胃癌、白血病、肝癌等多種腫瘤有顯著作用[3～6]，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究利用雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究其在抑制膠質(zhì)瘤侵襲性生長中的作用及其分子機(jī)制，探索神經(jīng)膠質(zhì)瘤的有效輔助治療方法。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

雷公藤內(nèi)酯醇，純度＞98%，購自成都曼斯特生物科技有限公司，用二甲基亞砜（DMSO）助溶，10 g/L，–20℃保存，用前用DMEM培養(yǎng)液稀釋到終工作濃度（DMSO終濃度＜0.1%）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于全式金公司；P65抗體購自美國Abgent公司；CB和MMP-9抗體為美國Datasheet公司，二抗購自北京中杉金橋生物公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司。

1.2 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株購自上海中科院細(xì)胞庫。人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞在含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2 d換液傳代1次，取細(xì)胞活性＞98%的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長期的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL，每孔200 μL接種于96孔板中，24 h后分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組重復(fù)5孔。對(duì)照組以培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組加入雷公藤內(nèi)酯醇，質(zhì)量濃度為1，5，25，50，100，200 μg/L，培養(yǎng)24 h后，每孔加人5 g/L的MTT溶液20 uL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，吸去培養(yǎng)上清液，每孔加入150 uL的DMSO溶液，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解后于M450酶標(biāo)儀測定492 nm波長處的各孔吸光度（A），每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率及IC50值。細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組A／對(duì)照組A）×100%。

1.4 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)

將Transwell小室置于滅菌的24孔板中，用80 uL 1∶8稀釋的Matrigel膠覆蓋小室內(nèi)膜，室溫30 min放置風(fēng)干，使Mattigel形成凝膠。每孔加入50 uL含10 g/L BSA的無血清培養(yǎng)基水化基底膜，在外室內(nèi)加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。空白對(duì)照組和25 μg/L雷公藤內(nèi)酯醇作用24 h組細(xì)胞用無FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)細(xì)胞/mL，取200 uL加入內(nèi)室，重復(fù)3組，常規(guī)培養(yǎng)48 h。取出小室，棄去培養(yǎng)液，用棉簽擦去微孔膜內(nèi)層細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡（×250）下計(jì)數(shù)穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)。每組細(xì)胞隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，求出其平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Real-Time PCR檢測組織蛋白酶 B（Cathepsins B，CB），基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）基因表達(dá)

雷公藤內(nèi)酯醇處理24 h后，提取各組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的總RNA，用核酸儀檢測RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，Real-Time PCR擴(kuò)增。Cathepsins B 基因引物序列：上游引物5'-CTGCAGCGCTGGGTGGATCTAGGAT-3'；下游 引 物5'-ACGTTGTAGAAGTTGTGCCCGGC-3'；MMP-9基 因 引 物 序 列： 上 游 引 物（5'-TGTGCTCTTCCCTGGAGACCTGA-3'；下游引物5'-ATGGCCTTCAGCGTGGCGCTAT-3'。內(nèi)參β-actin引物序列：上游引物5'- TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'；下游引物5'- CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'。ABI7300 Real-Time PCR擴(kuò)增儀兩步法擴(kuò)增，反應(yīng)條件，變性95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以2-△△CT值表示，△CT=CT（目的基因）-CT（內(nèi)參）。

1.6 Western印跡法檢測CB， MMP-9表達(dá)變化

收集空白對(duì)照組及25 μg/L雷公藤內(nèi)酯醇處理48 h的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度后備用。各組去等量蛋白用10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳、PVDF膜濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入P65（1∶1000）、CB（1∶1000）、MMP-9（1∶300）一抗，在4℃下孵育過夜。漂洗過后再加入二抗（1∶5000），于搖床室溫孵育1 h。最后與ECL化學(xué)發(fā)光試劑孵育，曝光、沖洗、顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

雷公藤內(nèi)酯醇作用U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞24 h后檢測IC50值是25.36 μg/L，不同質(zhì)量濃度雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)U87細(xì)胞的抑制率如圖1所示，雷公藤內(nèi)酯醇質(zhì)量濃度越高，增殖抑制作用越顯著，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖1 不同質(zhì)量濃度雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)U87細(xì)胞的抑制率Figure 1 The concentration-dependent effect of triptolide on the U87 cell viability

2.2 U87細(xì)胞體外侵襲力的影響

Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞組中侵襲入下室的細(xì)胞數(shù)目為：空白對(duì)照組平均102.5±6.5個(gè)，雷公藤內(nèi)酯醇組平均55.4±9.1個(gè)，經(jīng)雷公藤內(nèi)酯醇作用24 h后U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05）有顯著性差異。如圖2所示。

圖2 雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)U87細(xì)胞體外侵襲力的影響（×250）Figure 2 Effect of triptolide on cell invasion in U87 cell in vitro

2.3 Real-Time PCR檢測U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞CB、MMP-9基因表達(dá)的影響

雷公藤內(nèi)酯醇處理24 h后U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的CB，MMP-9基因的mRNA的表達(dá)較空白對(duì)照組均明顯下降。CB基因和MMP-9基因的2-△△CT值分別是0.64 和0.28（P＜0.05），與空白組對(duì)比有顯著差異。

2.4 雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞CB、MMP-9的蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用24 h后與空白對(duì)照組相比雷公藤內(nèi)酯醇組的CB、MMP-9的蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，有顯著性差異，結(jié)果如圖3所示。

3 討論

顱內(nèi)高度惡性的神經(jīng)膠質(zhì)瘤，呈侵襲浸潤性生長，手術(shù)難以全部切除，早期就可出現(xiàn)腦組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[7]，抑制其侵襲性是改善預(yù)后的重要治療方法。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的浸潤侵襲生長涉及細(xì)胞外基質(zhì)的降解、腫瘤細(xì)胞的遷移、腫瘤細(xì)胞的黏附等多個(gè)過程[8]，抑制相關(guān)過程可以降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

在膠質(zhì)瘤的侵襲生長過程中組織CB及MMP-9起著十分重要的作用[9～10]，表達(dá)水平與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。在膠質(zhì)瘤中CB為高表達(dá)，CB的釋放使細(xì)胞外基質(zhì)成分降解，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的侵襲。CB能激活尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒靧PA以及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）。MMP-9是MMPs 家族成員，是膠質(zhì)瘤侵襲過程中發(fā)揮著降解細(xì)胞外基質(zhì)和調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的重要作用。CB和MMPs在膠質(zhì)瘤的侵襲過程中發(fā)揮協(xié)同作用，能有效降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤浸潤侵襲，其中的MMP-2和MMP-9還與膠質(zhì)瘤的惡性級(jí)別密切相關(guān)[11]，抑制MMP-9的表達(dá)，能有效降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤的侵襲性[12]，而高表達(dá)MMP-9的膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)[13]。

圖3 雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)MMP-9，CB蛋白表達(dá)的影響（western blot）Figure 3 The effect of triptolide on MMP-9 and CB protein level

表1 Cathepsins B基因表達(dá)水平變化 n=3 （P＜0.05）Table 1 Cathepsins B gene expression level n=3 （P＜0.05）

表2 MMP-9基因表達(dá)水平變化 n=3 （P＜0.05）Table 2 MMP-9 gene expression level n=3 （P＜0.05）

本研究結(jié)果表明雷公藤內(nèi)酯醇以劑量-效應(yīng)方式抑制U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性。同時(shí)通過細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用24 h后侵襲能力明顯下降，侵入Transwell外室的腫瘤細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組明顯減少。結(jié)果提示雷公藤內(nèi)酯醇能降低U87膠質(zhì)細(xì)胞水解細(xì)胞外基質(zhì)能力，使之難以通過微孔膜，從而顯著降低其侵襲能力。

本實(shí)驗(yàn)PCR結(jié)果表明雷公藤內(nèi)酯醇能顯著地降低U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的CB及MMP-9的mRNA表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示雷公藤內(nèi)酯醇能明顯下調(diào)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的CB蛋白及MMP-9蛋白的表達(dá)。因此雷公藤內(nèi)酯醇可能在轉(zhuǎn)錄水平降低CB及MMP-9的mRNA表達(dá)，調(diào)控CB及MMP-9的轉(zhuǎn)錄及合成，從而抑制二者的蛋白合成。雷公藤內(nèi)酯醇可以通過抑制U87細(xì)胞的CB及MMP-9基因的表達(dá)從而減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞水解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，使膠質(zhì)瘤的侵襲性降低。

綜上所述雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性生長具有抑制作用，其作用機(jī)制可能為通過抑制CB及MMP-9表達(dá)，減弱膠質(zhì)瘤水解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，發(fā)揮抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長的重要作用，這為治療膠質(zhì)瘤提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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The anti-invation effect of triptolide for U87 glioma in vitro

LI Jianbin1, ZAI Yuping2, ZHU Xingen1, LV Shigang1, LIU Feng1, CHENG Zhujue1★
(1.Department of Neurosurgery, The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Jiangxi, Nanchang 330006, China. 2. Department of Neurosurgery, Hukou Hospital, Jiangxi, Jiujiang 332500, China)

Objective To study the anti-invation effect of triptolide for U87 glioma cells and its molecular mechanism. Methods MTT assay was used to determine the growth inhibition by triptolide in glioma U87 cells. Tumor invasion and migration were examined by Transwell Chamber assay. Real-Time PCR and Westerm b1ot was conducted to detect including the alteration of Cathepsins B (CB) and MMP-9. Results

Triptolide could signi fi cantly inhibite glioma U87 cell proliferation, reduce the cell ability of invasion, downregulating MMP-9 and CB expression level. Conclusion Triptolide could depress the invasion of glioma cells owing to down-regulating the expression level of MMP-9 and CB, reduce the ability of hydrolyzing extracellular matrix in vitro.

Triptolide; Glioma; Invasion

江西省教育廳項(xiàng)目（EF130）

1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西，南昌 330006 2.湖口縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江西，九江332500

★通信作者：程祖玨，E-mail:juejue@126.com