實時熒光定量PCR法與基因芯片法檢測HPV的比較

曾華劉曉強莊豪鄭明慧李烈軍

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實時熒光定量PCR法與基因芯片法檢測HPV的比較

曾華1劉曉強1莊豪1鄭明慧1李烈軍2★

目的比較基于PCR的基因芯片方法和實時熒光定量PCR方法檢測女性子宮頸脫落細胞HPV DNA的相關性。方法收集2050份樣本采用基因芯片法和實時熒光定量PCR方法進行比對試驗，兩者結(jié)果不符的進行測序驗證，并對檢測結(jié)果進行一致率及陽性率統(tǒng)計分析。結(jié)果兩種方法總一致率、陽性一致率及陰性一致率都在95.0%以上；熒光定量PCR法檢測HPV16陽性率50.0%，HPV18陽性率13.9%。結(jié)論兩種方法檢測的一致性良好，本實驗中所使用的新型12+2高危型人乳頭狀瘤病毒核酸檢測試劑盒適合應用于育齡期婦女的宮頸癌篩查及隨訪。

基因芯片法；實時熒光PCR；12+2高危HPV；21分型

自1977年，Laverty在電鏡中觀察到宮頸癌活檢組織中人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）顆粒的存在[1]，目前，已通過DNA檢測技術發(fā)現(xiàn)90%以上的宮頸癌病人都存在HPV持續(xù)感染。至今發(fā)現(xiàn)的HPV約有100多種，根據(jù)HPV感染人體后可致宮頸癌的相關性，分為低危型HPV以及高危型HPV。研究表明[2]，宮頸癌組織中HPV16和HPV18型感染率最高，故本文對12型高危HPV進行定性檢測，同時定量檢測HPV16、HPV18型。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本研究對象為2011年4月至2011年12月在中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院婦科門診和體檢中心進行婦科檢查的2050例女性患者。年齡為36.48±9.38（±s），最小17歲，最大73歲。

1.2 樣本采集

1.2.1 標本采集要求

①3天內(nèi)不使用陰道內(nèi)藥物或?qū)﹃幍肋M行沖洗；②24小時內(nèi)不應有性行為；③檢查應在非月經(jīng)期內(nèi)進行；④檢查前陰道不進行醋酸或碘液涂抹。

1.2.2 標本采集及保存

標本采集：由醫(yī)生以窺陰器暴露宮頸，用棉拭子將宮頸過多的分泌物擦去。將宮頸刷置于宮頸口，輕輕搓動宮頸刷使其順時針旋轉(zhuǎn)3～5圈。慢慢取出宮頸刷，將其放入裝有細胞保存液的樣品管中。在管口處將多余的刷柄折斷，將刷頭留在樣品管中，旋緊管蓋，做好標本標識并保持洗脫管直立放置送檢驗室檢測。

標本保存：送檢標本如不能馬上送檢，存放于4℃保存，并于2個星期之內(nèi)進行檢測。

1.3 試劑及儀器

使用試劑及儀器情況見表1。

1.4 檢測方法

1.4.1 DNA模板的準備

①取宮頸脫落細胞標本0.5～1 mL（如果細胞數(shù)量少可以加大體積到2 mL）。②13000 r/min 離心1 min。③棄上清，加入0.5 mL細胞保存液重懸細胞。④13000 r/min離心1 min，盡量棄干凈上清。⑤每樣本加入50μL細胞裂解液，充分振蕩重懸細胞，煮沸10 min。⑥13000 r/min離心10 min，保留上清備用（上清中為釋放的DNA）。

1.4.2 實時熒光PCR檢測

用提取的DNA作為模板在ABI7500上擴增，嚴格按照說明書操作。

1.4.3 基因分型檢測

采用HPV分型檢測試劑盒（PCR+膜雜交法）檢測21種HPV基因型。用提取的DNA作為模板在ABI9600 PCR儀上擴增，之后將PCR產(chǎn)物在HybriMax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀HHM-2I完成雜交分型。

1.4.4 測序

對于熒光定量PCR法和基因芯片法檢測結(jié)果不一致的樣本，將PCR產(chǎn)物及相應測序引物交英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行DNA序列測定，并以測序法結(jié)果作為金標準。

1.5 統(tǒng)計學處理

基于Excel數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)計分析用SPSS17.0?處理。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR法與基因芯片法檢測結(jié)果

熒光定量PCR法檢測可對16、18分型，合并檢測31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68，實驗結(jié)果見圖1。當熒光定量PCR法檢測結(jié)果為陽性，若型別與基因芯片法檢測的結(jié)果不一致，則定義為不相符，共有92例，分析結(jié)果見表2。由表2見，熒光定量PCR法檢測與基因芯片法檢測的總一致率為95.5%（1958/2050）；陽性一致率為95.9%（786/820）；陰性一致率為95.3%（1172/1230）。

2.2 測序法檢測結(jié)果

兩種方法檢測結(jié)果不一致共有92例，采用測序的方法進行驗證，測序圖見圖2。一致性分析見表3，以測序結(jié)果為金標準，熒光定量PCR法檢測結(jié)果吻合例數(shù)率為45%；基因芯片法檢測結(jié)果吻合率為55%。

表1 使用試劑及儀器情況Table 1 The reagent and instrument

表2 熒光定量PCR法與基因芯片法檢測結(jié)果一致性分析Table2 Consistency analysis between real-time fl uorescent PCR and gene-chip

2.3 熒光定量PCR法檢測陽性結(jié)果型別分類

將熒光定量PCR法檢測陽性的798例標本進行型別分析，HPV16陽性有399例，占50.0%；HPV18陽性有111例，占13.9%；其余12型高危陽性有288例，占36.1%。（表4）

3 討論

圖1 熒光定量PCR檢測結(jié)果Figure 1 Result of PCR- fl uorescence probing assay

表3 兩種檢測方法與測序結(jié)果的一致性分析Table 3 Consistency analysis between sequencing fi gure and two detection methods

圖2 HPV各型別陽性測序圖Figure 2 HPV sequencing fi gure

表4 熒光定量PCR法檢測陽性檢測結(jié)果分類Table 4 The classi fi cation of positive results in real-time fl uorescent PCR

早在1977年，Laverty[3]在電鏡中觀察到宮頸癌活檢組織中有HPV顆粒的存在，以及Zur Hausen[4]提出HPV病毒與宮頸癌發(fā)病相關聯(lián)的假設后，國內(nèi)外學者進行了大量的研究，并在1995年的IARC專題討論會上達成了HPV感染是宮頸癌的主要原因的觀點。根據(jù)HPV感染人體后可致宮頸癌的相關性，將其分為低危型HPV以及高危型HPV。低危型HPV可導致生殖器尖銳濕疣，影響生活質(zhì)量；高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宮頸癌及高度宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變，其已明確的高危型HPV型別主要有HPVl6、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型等。宮頸癌患者中，HPV16和HPV18型感染率最高[5]。

高危型HPV導致癌癥的機會較高，在99.8%的宮頸癌患者中發(fā)現(xiàn)HPV的感染[6]，現(xiàn)已知至少有13種高危型HPV與95%的早期浸潤和浸潤性子宮頸癌有關[7]。世界衛(wèi)生組織明確提出13種HPV高危型應該單獨或聯(lián)合細胞學應用于宮頸癌篩查[8]。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）宮頸癌篩查實踐指南及美國陰道鏡檢查與宮頸病理學會（American Society for Colposcopy and Cervical Pathology，ASCCP）[9]另外指出，檢測高危型HPV時，HPV16和HPV18必須特別重視。他們明確指出即使宮頸細胞學無異常而HPV陽性的30歲以上女性，如其為HPV16、HPV18感染者，應立即進行陰道鏡檢查。亞洲婦女宮頸癌組織中HPV常見型別最新報道顯示[10]：無論是在西亞和東亞地區(qū)，HPV16和HPV18都是感染率最高的型別。

由于宮頸病變的嚴重程度與感染HPV的具體亞型相關，在單一感染型別中，HPV16占居首位并隨病變級別增加而陽性率逐步增高。Clifford等[11]發(fā)現(xiàn)HPV16在宮頸浸潤癌（invasive cervical cancer）患者中的檢出率是低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL） 中 的 2倍，HPV18是1.5倍，說明感染HPV16、HPV18更容易進展為宮頸浸潤癌。同時研究表明，HPV16的感染由于清除率降低可能更易導致持續(xù)性感染，發(fā)生CIN2、3（cervical intraepithelial neoplasia II，III），甚至SCC（squamous cell carcinoma）[12]。因此對于HPV感染患者不僅需要重視其是否已經(jīng)導致宮頸病變，還要重視其感染的具體型別，特別是HPV16、HPV18型感染患者應密切隨訪。綜上所述，HPV分型檢測，特別是HPV16、HPV18的分型檢測比13種高危型綜合籠統(tǒng)歸類檢測更具臨床指導意義。故本文研究的HPV12+2高危型檢測試劑盒應用于育齡期婦女的宮頸癌篩查及隨訪意義重大。

目前臨床上常用的宮頸細胞學檢查方法主要有兩種：巴氏涂片法（即宮頸刮片）和液基薄層細胞學檢查法（TCT）[13]，由于主觀因素的影響，這兩種方法的假陰性較高，容易造成漏診。因此，采用合理、廉價的篩查方法，對提早預防、診斷和治療宮頸癌有非常重要的意義。

本研究采用的HPV基因分型檢測試劑盒（PCR+膜雜交法），現(xiàn)已廣泛應用于宮頸疾病的診治全過程，可降低宮頸病變的漏診以及避免過度治療，目前已成為宮頸疾病的隨訪指標，在臨床中發(fā)揮著重要作用。但該試劑盒存在成本較高，操作步驟復雜等，臨床應用受到一定限制。美國HC2捕獲雜交法（13種高危型檢測試劑盒）及國內(nèi)現(xiàn)有的13種高危型HPV核酸擴增熒光檢測試劑盒，具有操作簡單，自動化程度高的優(yōu)點，但不能直接對HPV進行分型，特別是無法直接鑒定HPV16和HPV18，在臨床應用中存在一定的不足。

而本研究中所使用的12+2高危型人乳頭狀瘤病毒核酸檢測試劑盒，以實時熒光定量PCR核酸檢測為技術平臺，在同一試管中，既能檢測12種高危型HPV，又能同時將HPV16、HPV18分型（表4），且操作簡單。因此，通過本研究，比較此新型12+2高危HPV核酸檢測試劑盒與市場上已有質(zhì)量較好的基因分型試劑盒在臨床上的使用情況，評價這種新型試劑盒的使用價值，而根據(jù)試驗結(jié)果可推斷，此12+2高危HPV檢測試劑盒用于臨床檢驗是有效和安全的。

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Real-time quantitative PCR and Gene-chip in detecting human papilloma virus

ZENG Hua1, LIU Xiaoqiang1, ZHUANG Hao1, ZHENG Minghui1, LI Liejun2★
(1.Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangdong, Guangzhou 510120, China; 2.Chaozhou Hybribio Limited Corporation, Guangdong, Chaozhou 521000, China)

Objective To explore the correlation of HPV DNA test between gene-chip based on PCR technique and real-time fl uorescent PCR in cervical exfoliated cells. Methods 2050 samples were measured by the gene-chip and real-time fl uorescent PCR, which inconsistent results would be veri fi ed by sequencing, and statistical analysis of the consistent rate and positive rate. Results The total concordance rate, the positive concordance rate and the negative concordance rate of the two detection methods were more than 95.0%. The positive rate of HPV16 and HPV18 detected by fl uorescence quantitative PCR method were 50.0% and 13.9%, respectively. Conclusion The consistence of two detection methods was good, and HPV12+2 type detection kit was suitable for application in the childbearing age women at risk of cervical cancer screening and follow-up.

Gene-chip; Real-time fl uorescent PCR; High risk HPV12+2; 21 types

1.中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院檢驗科，廣東，廣州 510120 2.潮州凱普生物化學有限公司，廣東，潮州 521000

★通訊作者：李烈軍，E-mail:ljli@hybribio.cn