乙醛脫氫酶2基因在畢赤酵母中的表達(dá)和分離純化

陳 瑞，方 劍，王靜涵

（1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，六安237012；

2.皖西學(xué)院安徽省植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，六安237012）

乙醛脫氫酶2基因在畢赤酵母中的表達(dá)和分離純化

陳 瑞1，2，方 劍1，王靜涵1

（1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，六安237012；

2.皖西學(xué)院安徽省植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，六安237012）

將乙醛脫氫酶2（ALDH2）基因整合到質(zhì)粒pPIC9K上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9K?coALDH2，用電轉(zhuǎn)導(dǎo)將表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K?coALDH2轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，在畢赤酵母中表達(dá)經(jīng)密碼子改造的ALDH2。結(jié)果表明：重組基因工程菌GS115（pPIC9K?coALDH2）發(fā)酵液中蛋白質(zhì)量濃度為8.40 mg／L，1 m L發(fā)酵液中酶活為11.35 mU。

乙醛脫氫酶；GS115；表達(dá)

乙醛脫氫酶2［1］（aldehydehyde dehydrogenase，ALDH2）是一種主要分布在動(dòng)物肝、胃等器官中的氧化還原酶，它能催化乙醛與乙酸之間的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，是人體代謝乙醇的關(guān)鍵酶［2］。Ge等［3］的研究表明：ALDH2能夠減輕缺氧而導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋零；對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞也有減輕缺氧損傷的作用。葉紅偉等［4］用離體大鼠心臟，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30 min模擬局部心肌缺血，松開(kāi)結(jié)扎線恢復(fù)灌流120 min復(fù)制心肌缺血，再灌注（I／R）模型。結(jié)果表明與I／R組比，法舒地爾組明顯促進(jìn)了左室發(fā)展壓、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率、左心室做功的恢復(fù)，降低復(fù)灌期冠脈流出液中LDH的釋放，ALDH2 mRNA表達(dá)增加，Bcl?2／Bax比值增高。

關(guān)于乙醛脫氫酶的研究有很多，其分離純化、誘導(dǎo)、激活均有所報(bào)道。還有通過(guò)基因工程在原核生物和植物體內(nèi)對(duì)該酶基因進(jìn)行表達(dá)的研究，鞠建松等［5］從嗜堿芽胞桿菌中獲得乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的基因，構(gòu)建載體，通過(guò)原核表達(dá)，獲得乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶，但存在表達(dá)量低，失活嚴(yán)重等問(wèn)題。筆者通過(guò)研究乙醛脫氫酶基因在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)，得到具有活性的ALDH2，為開(kāi)發(fā)能夠預(yù)防和緩解乙醇對(duì)身體傷害的藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

菌株大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115（Mut＋，his4）和質(zhì)粒pPIC9K為安徽省植物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心保藏。

1.1.2 試劑

Tris、SDS、限制性內(nèi)切酶Sac I、Bam I、Eco RⅠ以及T4連接酶、Taq酶，寶生物工程有限公司；葡萄糖、異丙醇、乙醇等均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

TGRADIEN PCR儀（德國(guó)Biometra公司），DYY-10C型電泳儀（北京六一儀器廠），G：BOX高級(jí)凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Syngene公司），722S可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），UNIVERSAL32R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司），THZ-D型臺(tái)式振蕩恒溫培養(yǎng)箱（太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌表達(dá)載體的構(gòu)建［6］

將質(zhì)粒pPIC9K和含有目的序列的pUC57?coALDH2分別用Eco RⅠ和BamⅠ雙酶切，再電泳并回收目的序列和酶切后的pPIC9K。用T4連接酶將目的序列插入至pPIC9K的Eco RⅠ和BamⅠ雙酶切缺口，得到pPIC9K?coALDH2并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中［7］，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

1.2.2 基因工程菌株的構(gòu)建［8］

構(gòu)建的質(zhì)粒pPIC9K?coALDH2轉(zhuǎn)化至P．pastoris GS115，電轉(zhuǎn)參數(shù)為1 500 V，5 ms。首先用SacⅠ線性化質(zhì)粒并回收，再使用電轉(zhuǎn)化儀轉(zhuǎn)化至畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后畢赤酵母涂于選擇平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 誘導(dǎo)表達(dá)

將PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性［9］的菌株在酵母膏葡萄糖YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d，培養(yǎng)條件為30℃、150 r／min。按1%接種量接種于畢赤酵母表達(dá)用培養(yǎng)基BMGY培養(yǎng)基中，25℃、250 r／min振蕩培養(yǎng)2～3 d，期間每24 h補(bǔ)加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的甲醇。誘導(dǎo)結(jié)束的發(fā)酵液8 000 r／min離心10 min，收集上清液，用SDS?PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.4 目標(biāo)蛋白含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法（CBB）［10］，首先配制標(biāo)準(zhǔn)小牛血清白蛋白（BSA）溶液100μg／mL，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，在595 nm處檢測(cè)吸光度。

1.2.5 酶活檢測(cè)［11］

酶活體系：1 mol／L Tris?HCl buffer（pH 8.0）300μL，20 mmol／Lβ-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（β?NAD）300μL，100 mmol／L乙醛200μL，3mol／L KCl 100μL，1 mol／Lβ-巰基乙醇30μL，酶液1 mL及水1.07 mL。

用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)酶活體系在340 nm處吸光度的變化值，反應(yīng)溫度為37℃，計(jì)算ALDH活性。為了討論方便，定義每分鐘波長(zhǎng)340 nm處吸光度變化0.01為1個(gè)活力單位（U）。

2 結(jié)果與討論

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

圖1為目的基因PCR結(jié)果及酶切鑒定的電泳鑒定圖。由圖1可以看出：第1、2泳道為pUC57?coALDH2雙酶切回收的1 500 bp目的片段，第3泳道為質(zhì)粒pPIC9K雙酶切后回收片段，大小為9 300 bp，與理論值相符。

圖1 酶切回收目的片段的電泳Fig.1 Results of restriction and extraction

2.2 基因工程菌的篩選鑒定

用GeneTools分析各回收片段濃度的比例。按插入片段和質(zhì)粒摩爾比2∶1混合回收的片段，用T4連接酶連接pPIC9K和coALDH2，并轉(zhuǎn)化到E．coli DH5α中。挑取篩選平板上的單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證后質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至P．pastoris GS115，得到重組菌P．pastoris GS115（pPIC9K?coALDH2）。提酵母總DNA后進(jìn)行PCR檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 以畢赤酵母基因組為模板的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of P．pastoris genome PCR amplification

由圖2可知：第1、2、5泳道為5′AOX1和3′ALDH為引物，PCR的擴(kuò)增結(jié)果（理論長(zhǎng)度1 867 bp）；第3、4、6泳道為a?factor和3′ALDH為引物，PCR的擴(kuò)增結(jié)果（理論長(zhǎng)度1 570 bp）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第1、2、3、4泳道為GS115（pPIC9K?coALDH2），結(jié)果為陽(yáng)性；5、6號(hào)泳道為對(duì)照（GS115），結(jié)果為陰性。說(shuō)明基因工程菌株構(gòu)建成功。

2.3 目標(biāo)蛋白的SDS?PAGE檢測(cè)

圖3為重組菌與對(duì)照菌發(fā)酵液的上清液的SDS?PAGE電泳分析結(jié)果。由圖3可以發(fā)現(xiàn)，目的蛋白的大小約為46 000，與乙醛脫氫酶的理論值相符［12］。

圖3 SDS?PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白Fig.3 SDS?PAGE analysis of target protein

2.4 目標(biāo)蛋白含量的測(cè)定

利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定目的蛋白，BSA蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可以看出，試樣中蛋白含量m＝0.27 919A-0.22 956，R2＝0.99 514。

由此計(jì)算出250μL試樣中目的蛋白含量為2.10 μg，發(fā)酵液中目的蛋白質(zhì)量濃度為8.40 mg／L。

圖4 蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of protein content

2.5 酶活檢測(cè)

發(fā)酵液中某些物質(zhì)在340 nm處吸光度較大，可以推測(cè)出該物質(zhì)主要是酵母的代謝產(chǎn)物。用PEG沉淀能較好地將目的蛋白與干擾物質(zhì)分開(kāi)，且PEG對(duì)酶有一定的保護(hù)作用，處理后酶活損失較少，結(jié)果比較穩(wěn)定，能基本反映發(fā)酵液中酶活的總量。

取1mL發(fā)酵液處理上清后，加入酶活體系測(cè)得乙醛脫氫酶的酶活為11.35 mU，比活力為1.35 U／mg。

3 結(jié) 論

以質(zhì)粒pPIC9K為載體，畢赤酵母P．pastoris GS115為宿主菌，構(gòu)建得到重組基因工程菌GS115（pPIC9K?coALDH），經(jīng)搖瓶發(fā)酵發(fā)現(xiàn)GS115（pPIC9K?coALDH）的蛋白表達(dá)量為8.40 mg／L，比酶活為11.35 mU／mL。通過(guò)研究乙醛脫氫酶基因在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)，得到純度較高、活性較高的ALDH2，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究乙醛脫氫酶的其他生理學(xué)作用，為開(kāi)發(fā)能夠預(yù)防和緩解乙醇對(duì)身體傷害的藥物奠定基礎(chǔ)。

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Expression of acetaldehyde dehydrogenase 2 gene in Pichia pastoris

CHEN Rui1，2，F(xiàn)ANG Jian1，WANG Jinghan1

（1.College of Biology and Pharmaceutical Engineering，West Anhui University，Lu′an 237012，China；2.Experiment and Training Center of Plant Biotechnology of Anhui Province，West Anhui University，Lu′an 237012，China）

To obtain acetaldehyde dehydrogenase 2（ALDH2），the pPIC9K?ALDH2 was linearized and transformed by electroporation into Pichia pastoris GS115，and the new engineering bacteria GS115（pPIC9K?co1ALDH）for overexpressing ALDH2 was obtained.The results showed that the content of target protein was 8.40 mg／L and the enzymatic activities in culture recombinant Pichia strains reached 11.35 mU／mL，and itwas higher than that in extracellular expression.

acetaldehyde dehydrogenase；GS115；express

Q78

A

1672-3678（2013）06-0034-04

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.007

2012-09-18

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目（201210376007）；六安市定向委托皖西學(xué)院市級(jí)研究項(xiàng)目（2012LW001）

陳 瑞（1985—），男，安徽六安人，碩士，研究方向：微生物學(xué)，E?mail：umeyama＠163.com