人乳腺癌上皮細(xì)胞miR-217對(duì)EZH2表達(dá)的調(diào)控作用

王璐璐，劉萃萃，郭 騰，陶 然，彭 攸，趙衛(wèi)衛(wèi)，王玉平，孫振亮，馮 景

(1蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇蘇州215000;2上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院)

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段的過(guò)程，其中組蛋白甲基化及DNA甲基化等發(fā)揮了重要作用［1，2］。homolog2 zeste 基因增強(qiáng)子(EZH2)定位于染色體7q35-6，是PcG基因家族的重要成員［3］，通過(guò)誘導(dǎo)組蛋白乙?；图谆缺碛^遺傳的發(fā)生來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［4］。EZH2高表達(dá)于多種腫瘤，如乳腺癌［5］。在前期研究中［6］，我們利用經(jīng)典分子生物學(xué)方法，結(jié)合慢病毒lenti-miRNAs文庫(kù)篩選出了包涵miR-217在內(nèi)的17個(gè)靶向EZH2的miRNAs。2012年3月21日～12月10日，我們通過(guò)RT-PCR、Western blot和雙熒光素酶報(bào)告基因等一系列實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)一步研究乳腺上皮細(xì)胞系中miR-217與EZH2之間的作用機(jī)制，為miR-217作為乳腺癌潛在治療靶點(diǎn)的體外研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 人正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100，乳腺癌上皮細(xì)胞系 MCF-7、MDA-MB-231，人胚腎細(xì)胞293T。DMEM高糖培養(yǎng)基。0．25%胰蛋白酶、青—鏈霉素(10 000 U/mL)。胎牛血清。TRIzol。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。實(shí)時(shí)定量PCR用 2×Mix、Syber Green染料、Mg2+。EZH2，18s、U6引物。5×蛋白裂解液。一抗EZH2。β-actin，二抗羊抗鼠。免疫印跡凝膠配置試劑。免疫印跡配膠、電泳、電轉(zhuǎn)裝置。A、B顯影液。轉(zhuǎn)染試劑Lipofecter C0516。miR-217檢測(cè)試劑盒，miR-217模擬物(miR-217 minics)、miR-217抑制劑(miR-217 inhibitor)轉(zhuǎn)染試劑盒。雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒，psiCHECKTM-2雙熒光素酶載體。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231 細(xì)胞中EZH2、miR-217基因檢測(cè) 用TRIzol提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RT-PCR。EZH2引物序列:上游為5'-TTCGGTAAATCCAAACTGCTAT-3'，下游為5'-GCCTGGCTGTATCTGTAATCAA-3';擴(kuò)增產(chǎn)物126 bp;反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共 35 個(gè)循環(huán)。miR-217引物序列:上游為 5'-TACTCAACTCACTACTGCATCAGGA-3'，下游為 5'-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3';擴(kuò)增產(chǎn)物84 bp;反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min，95℃變性12 s，60℃退火、延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。由PCR反應(yīng)曲線得到域值循環(huán)數(shù)(Ct)，以基因18s或U6作為內(nèi)參照，計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1．2．2 HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231 細(xì)胞中EZH2蛋白檢測(cè) 采用Western blot法。分別將收集的細(xì)胞加入適量蛋白裂解液，搖床上冰浴裂解15 min，加入適量蛋白loading buffer，100℃干浴鍋煮10 min，室溫冷卻后4℃保存。每泳道20μL蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，鼠抗人EZH2(1∶300)過(guò)夜，二抗羊抗鼠(1∶300)室溫孵育3 h，暗室中A、B液顯色，顯影，定影。以β-actin作為參照。蛋白表達(dá)量采用Launch Sensiansys軟件進(jìn)行灰度分析。

1．2．3 microRNAs的靶基因預(yù)測(cè) 采用 DIANA-microT、miRanda、PicTar、Target Scans 軟件共同預(yù)測(cè)miR-217的靶基因。

1．2．4 miR-217過(guò)表達(dá)與抑制實(shí)驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板。將10 nmol/L的miR-217 minics(實(shí)驗(yàn)組)及 miR-217 minics control(對(duì)照組)分別轉(zhuǎn)染到低表達(dá)miR-217的MDA-MB-231細(xì)胞中。將50 nmol/L的miR-217 inhibitor(實(shí)驗(yàn)組)及miR-217 inhibitor control(對(duì)照組)分別轉(zhuǎn)染到高表達(dá) miR-217的HBL-100細(xì)胞中。37℃的CO2培養(yǎng)箱孵育48 h后收集細(xì)胞。觀察miR-217、EZH2蛋白的表達(dá)。

1．2．5 雙熒光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 將含有miR-217識(shí)別位點(diǎn)的312 bp的EZH2 3'UTR(EZH2-UTR-WT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR產(chǎn)物亞克隆于psiCHECKTM-2雙熒光素酶載體上。海腎熒光素酶位于插入片段的上游，螢火蟲(chóng)熒光素酶位于插入片段的下游。應(yīng)用NCBI BLAST比對(duì)，miR-217與EZH2 3'UTR有8個(gè)連續(xù)的互補(bǔ)配對(duì)堿基(圖1)，將這8個(gè)堿基突變掉，構(gòu)建含miR-217突變位點(diǎn)的psiCHECKTM-2載體，即EZH2-UTR-MUT。利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofecter C0516將 1μg的質(zhì)粒和 50 nmol/L的 miR-217 minics轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。37℃的CO2培養(yǎng)箱孵育48 h后裂解細(xì)胞，進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。相對(duì)熒光素酶活性為海腎熒光素酶活性/螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。

圖1 miR-217與EZH2 3'UTR有8個(gè)連續(xù)的互補(bǔ)配對(duì)堿基

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以ˉx±s表示，比較用t檢驗(yàn)和單因素方差分析(ANOVA)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 乳腺上皮細(xì)胞系中miR-217的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)與HBL-100比較，miR-217在 MCF-7和 MDA-MB-231中顯著低表達(dá)(圖2)。

圖2 三種細(xì)胞中miR-217的表達(dá)

2．2 HBL-100比較，EZH2 mRNA在 MCF-7中高表達(dá)、MDA-MB-231中顯著高表達(dá)(圖3)。HBL-100中EZH2蛋白低表達(dá)，MCF-7、MDA-MB-231中EZH2蛋白高表達(dá)(圖4)。

圖3 三種細(xì)胞中EZH2 mRNA的表達(dá)

圖5 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MDA-MB-231細(xì)胞miR-217的表達(dá)

圖6 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MDA-MB-231細(xì)胞EZH2蛋白的表達(dá)

圖4 三種細(xì)胞中EZH2蛋白的表達(dá)

2．3 過(guò)表達(dá)或抑制miR-217對(duì)EZH2表達(dá)的影響PicTar、miRanda、Target Scans軟件都預(yù)測(cè)出 EZH2是miR-217的靶基因。MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-217 minics后，實(shí)驗(yàn)組miR-217表達(dá)量是對(duì)照組的21．67倍(圖5);與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組EZH2蛋白表達(dá)量下降了71．96%(圖6)。HBL-100細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-217 inhibitor后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組miR-217表達(dá)量下降了85．65%(圖7)，EZH2蛋白表達(dá)量增加了 179．63%(圖 8)。

2．4 miR-217對(duì)EZH2的靶向調(diào)控作用 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，293T細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染EZH2-UTR-WT和 EZH2-UTR-MUT載體48 h后，野生型EZH2-UTR-WT的相對(duì)熒光素酶活性是3．525，突變型EZH2-UTR-MUT的相對(duì)熒光素酶活性是5．365，兩者相比，P ＜0．05。

圖7 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組HBL-100細(xì)胞miR-217的表達(dá)

圖8 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組HBL-100細(xì)胞EZH2蛋白的表達(dá)

3 討論

研究表明，miRNAs通過(guò)與EZH2的3'UTR結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)EZH2表達(dá)，如 miR-26a、miR-98、miR-101、miR-124、miR-138和miR-214可分別在鼻咽癌、惡性膠質(zhì)瘤、肝癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤中通過(guò)靶向EZH2而抑制EZH2的表達(dá)［7～12］。

miR-217作為miRNAs家族中的一員，是一種多功能的miRNA。例如，miR-217可以通過(guò)靶向作用于KRAS抑制胰腺導(dǎo)管癌的發(fā)生［13］;在大鼠腎小球系膜細(xì)胞(MC)中 miR-216a協(xié)同 miR-217靶向PTEN 可促使 TGF-β 激活 AKt［14］;在人內(nèi)皮細(xì)胞中，隨著年齡的增長(zhǎng)miR-217逐漸增多，從而抑制SirT1的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的早期衰亡［15］;在人胚腎293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-217和miR-377，HO-1蛋白表達(dá)下降，HO-1酶活性減低;反之，將miR-217和miR-377同時(shí)干擾掉，HO-1蛋白的表達(dá)上升［16］;miR-217與miR-196a可作為判定是否患有胰腺導(dǎo)管癌或慢性胰腺炎的一個(gè)分子生物學(xué)標(biāo)志等［17］。但在乳腺上皮細(xì)胞中，miR-217與EZH2的作用機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，在正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100中，EZH2低表達(dá)，miR-217高表達(dá);在乳腺癌上皮細(xì)胞系MCF-7和 MDA-MB-231中，EZH2高表達(dá)，而miR-217低表達(dá);此結(jié)果與Tan等［18］報(bào)道相符。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-217 minics和miR-217 inhibitor，過(guò)表達(dá)和抑制miR-217，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-217時(shí)EZH2蛋白表達(dá)下降，抑制miR-217時(shí)EZH2蛋白表達(dá)上升。說(shuō)明miR-217可以下調(diào)EZH2的表達(dá)。利用293T細(xì)胞作為雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的工具細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染EZH2-UTR-WT及EZH2-UTR-MUT載體質(zhì)粒，48 h后進(jìn)行雙熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示兩者的相對(duì)熒光素酶活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明miR-217通過(guò)直接作用于EZH2 3'UTR下調(diào)EZH2表達(dá)。

總之，本研究結(jié)果表明，在乳腺癌上皮細(xì)胞中miR-217對(duì)EZH2的表達(dá)具有調(diào)控作用，且miR-217通過(guò)直接作用于EZH2 3'UTR調(diào)控EZH2表達(dá)。這為miR-217可能作為乳腺癌潛在治療靶點(diǎn)的體外實(shí)驗(yàn)研究提供了依據(jù)。

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