云南半細毛羊成纖維細胞系建立及其生物學(xué)特性分析

吳帥帥 ，李東江 ，呂春榮 ，權(quán)國波 ，郭成裕 ，洪瓊花

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)）

云南半細毛羊是以云南省昭通市飼養(yǎng)的山谷藏羊（昭通綿羊）和細毛雜交羊為基礎(chǔ)，引入羅姆尼公羊、林肯公羊，經(jīng)過育成雜交、橫交固定、自群繁育而培育成，2000年7月經(jīng)國家正式命名為“云南半細毛羊”。云南半細毛羊的育成填補了我國無粗檔半細毛羊品種的空白。然而，近年來由于市場導(dǎo)向的變化，云南半細毛羊數(shù)量出現(xiàn)逐步下降的趨勢［1］，因此非常有必要開展云南半細毛羊種質(zhì)資源保存的研究。相對于傳統(tǒng)的活體保存而言，體細胞保存具有明顯優(yōu)勢，如占用場地小、投資小、不受群體和個體生理利用年限制約可以長期保存種質(zhì)資源等。此外，建立云南半細毛羊體細胞系對于開展其相關(guān)生物技術(shù)研究，如體細胞克隆和轉(zhuǎn)基因動物制作具有非常重要的意義。

目前，尚未見到云南半細毛羊皮膚成纖維細胞系的相關(guān)報道。本實驗采用組織塊培養(yǎng)法和冷凍保存技術(shù)首次建立了云南半細毛羊成纖維細胞系，并對其培養(yǎng)條件和細胞生物學(xué)特性進行了系統(tǒng)研究，以期為云南半細毛羊種質(zhì)資源保存和相關(guān)生物技術(shù)的開展提供必要的資源和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 云南半細毛羊來自種羊場。

1.1.2 主要試劑、儀器

1）本研究中所用的化學(xué)試劑除特別說明外，均為Sigma公司生產(chǎn)，培養(yǎng)用DMEM、胎牛血清（FBS）由Gibco公司生產(chǎn)。一次性塑料培養(yǎng)皿為Nunclon公司生產(chǎn)。

2）主要儀器設(shè)備：倒置顯微鏡（Olympus，Nikon）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo）；實體顯微鏡（Olympus）；細胞計數(shù)儀等。

1.2 方法

1.2.1 耳源組織塊的收集 云南半細毛羊耳尖消毒去毛后剪取0.5 cm2大小的皮塊，置于4℃保存液中，2 h內(nèi)帶回實驗室培養(yǎng)。保存液為DMEM＋10%FBS＋200 u/mL青霉素＋200 u/mL鏈霉素。

1.2.2 原代細胞培養(yǎng) 無菌組織塊用生理鹽水液反復(fù)洗滌3次，然后用眼科剪剪成碎塊，置于直徑為50 mm培養(yǎng)皿中，每皿10塊進行培養(yǎng)。所用培養(yǎng)液為DMEM添加10%FBS，在5%CO2、飽和濕度和37.0℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞長出后開始換液，之后每3天換液1次。

1.2.3 細胞傳代及成纖維細胞的純化 待培養(yǎng)皿基本鋪滿單層細胞，去除培養(yǎng)液添加胰蛋白酶-EDTA（0.15%胰蛋白酶，0.02%乙二胺四乙酸）（TE）消化液控時控溫消化。倒置顯微鏡觀察，在成纖維細胞離壁前立即添加含有血清的培養(yǎng)液終止消化，制成細胞懸液，再移至離心管中，經(jīng)1 600 r/min離心5 min后棄上清，按照傳代前與傳代后1∶2的細胞數(shù)目比例對細胞進行傳代培養(yǎng)，每隔24 h進行換液。等細胞匯合度達80%～90%時，進行下一次傳代。原皿中貼壁較緊的細胞，可換液繼續(xù)培養(yǎng)［2］。

1.2.4 細胞凍存與解凍 對數(shù)生長期細胞，經(jīng)TE消化制成細胞懸液，1 600 r/min，離心5 min濃縮后，用凍存液調(diào)整細胞濃度為 1×106～1×107個/mL，充分混勻，分裝凍存管，放入凍存盒中于-70°C過夜，而后投入液氮中保存［3］。細胞凍存液為DMEM+10%FBS+10%DMSO。解凍在42℃水浴鍋中進行，用DMEM+10%FBS液逐漸稀釋凍存液，離心洗滌細胞3次，用培養(yǎng)液調(diào)整細胞懸液的濃度至1×105個/mL左右接種于24孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨機選取3個孔，以解凍后24 h細胞貼壁率為指標，計算細胞貼壁率，評價凍存效果。

1.2.5 細胞生物學(xué)分析實驗 以云南半細毛羊第7代細胞作為對照，分別對第7、12、17代細胞進行以下分析。

1.2.5.1 細胞活率測定 采用PI染法，對凍存前后的第7、12、17代細胞染色，統(tǒng)計計算細胞存活率。

1.2.5.2 生長曲線繪制 將第7、12、17代的細胞濃度調(diào)整到3×104個/mL，接種于24孔板內(nèi)。從接種時間起，每隔24 h計數(shù)3孔內(nèi)細胞數(shù)，取3個孔細胞數(shù)目的平均值，連續(xù)計數(shù)，繪制細胞生長曲線。

1.2.6 染色體制備 在對數(shù)生長期細胞中加入終濃度為0.25 μg/mL秋水仙素培養(yǎng)2.5 h。胰酶消化細胞制成細胞懸液，經(jīng)1 600 r/min離心5 min，棄上清。加入0.075 mol/L的氯化鉀于室溫下放置40 min，離心棄上清。第一次固定時，加入5 mL甲醇與冰乙酸的混合液體（積比為3∶1）（現(xiàn)用現(xiàn)配）固定30 min。離心棄上清。再經(jīng)第二、三次固定，方法同第一次。棄上清，留0.5～1.0 mL制成細胞懸液，用100 μL移液器吸取細胞懸液，滴在冰冷潔凈的載玻片上。于75℃烤箱中干燥3 h，Giemsa染色20 min。

1.2.7 核型分析 挑選形態(tài)清晰、分散度良好、收縮適中的染色體中期分裂相，在油鏡下拍照，并統(tǒng)計染色體數(shù)目。利用ADOBEPHOTOSHOP 7.0軟件進行染色體剪貼，對同源染色體進行配對、測量、排隊，并按Levan等的標準確定著絲粒類型［3］。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 細胞活率計數(shù)中的數(shù)據(jù)，經(jīng)3次測量取平均值獲得。生長曲線中各組數(shù)據(jù)，均通過6次計數(shù)取平均值獲得。染色體相對長度經(jīng)過3次測量，取平均值所得，并進行標準差計算。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)

組織塊在添加10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d后，成纖維細胞開始沿組織塊向周圍溢出，隨后有致密的上皮細胞貼壁延展生長。成纖維細胞與上皮細胞之間有明顯界限，前者為梭形，遷移能力強，細胞間隙大，后者為不規(guī)則的圓形或橢圓形，細胞之間沒有空隙。詳見圖1。

圖1 云南半細毛羊耳緣組織細胞培養(yǎng)

2.2 凍存對皮膚成纖維細胞形態(tài)及生物學(xué)特性的影響

以DMEM+10%FBS+10%DMSO作為冷凍保護液對云南半細毛羊成纖維細胞進行冷凍保存（圖2-A、B，表1）。結(jié)果顯示：第7、12、17代細胞在凍存前細胞活率并無明顯差別，解凍后細胞活率分別為89.3%、88.9%和87.9%，去除細胞凍存液培養(yǎng)24 h后貼壁率分別為88.9%、88.4%和87.1%。細胞經(jīng)體外培養(yǎng)4～5代，細胞形態(tài)保持初始狀態(tài)（圖2-C）。

表1 成纖維細胞凍存后培養(yǎng)%

圖2 云南半細毛羊成纖維細胞解凍后培養(yǎng)

2.3 細胞生長曲線

對云南半細毛羊第7、12、17代細胞進行連續(xù)7 d計數(shù)，然后繪制細胞生長曲線（圖3）。不同代次的細胞生長曲線均為“S”型，細胞倍增時間分別為26、42、47 h。

2.4 細胞染色體數(shù)目分析

參照舒琥等［4］已發(fā)表計數(shù)方法，分別進行第 7、12、17代細胞的核型分析（圖4-D、E、F）。每代取100個分裂相進行統(tǒng)計。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，云南半細毛羊染色體中正常二倍體染色體（2n=54）所占比例分別為93%、86%和81%，伴隨著代次增加，染色體數(shù)目變異呈逐步增加的趨勢（表2）。

圖3 云南半細毛羊成纖維細胞生長曲線

圖4 不同代數(shù)云南半細毛羊細胞中期染色體（1 000×）

表2 云南半細毛羊養(yǎng)細胞的染色體倍性分析

2.5 核型分析

測量結(jié)果表明，染色體組總相對長度197.86，平均相對長度3.66。參照Levan等［3］的命名法，以著絲點位置為判斷依據(jù)，對云南半細毛羊的染色體進行了分類，常染色體中有3對為中著絲點染色體，23對為端著絲點染色體，X染色體為最大的近端著絲點染色體，Y染色體為最小的亞中著絲點染色體。

圖5 云南半細毛羊核型圖（1 000×）

3 討論

組織塊培養(yǎng)原代細胞所需的時間較長，操作比較復(fù)雜，但生長的細胞比較整齊，不會由于酶的長時間作用而造成細胞的損傷或遺傳特性的改變。本實驗表明，組織塊培養(yǎng)5 d后，周圍開始溢出成纖維樣和上皮樣細胞，這與Guan等［5］的報道相一致。

在細胞保存過程中，需要盡可能降低細胞內(nèi)冰晶的形成，從而保持解凍后細胞活性、黏附能力及代謝活性［6］。本實驗表明，以DMSO為凍存保護劑可以滿足冷凍保存云南半細毛羊皮膚成纖維細胞的要求。

云南半細毛羊成纖維細胞體外培養(yǎng)的生長速度，會隨著細胞培養(yǎng)代數(shù)的增加而延長，細胞的適應(yīng)期也變長。此外，在細胞的傳代培養(yǎng)過程中，隨著代數(shù)的增加，細胞的二倍染色體數(shù)目異常的比例呈逐步上升趨勢，細胞遺傳穩(wěn)定性有所改變。該現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于細胞本身端粒酶長度的縮短［7］或者體外培養(yǎng)環(huán)境對細胞的DNA造成的損傷［8-9］。

在進行核型制備時，不同濃度秋水仙胺、低滲液、處理時間以及滴片時溫差等均可對染色體的相對長度和臂比值等產(chǎn)生影響［10］。此外固定和滴片也是核型分散成功的保證［11］，適當(dāng)?shù)牡纹叨纫彩侨旧w分散良好的重要條件［12］。實驗最終確定了制備云南半細毛羊細胞核型的最優(yōu)條件，即用0.25 μg/mL終濃度的秋水仙胺處理培養(yǎng)細胞2.5 h，低滲40 min，1.5 m滴片，可得到數(shù)量多、分散度好的細胞中期染色體。在云南半細毛羊染色體長度的測定計算中，實驗對多個中期染色體分裂相進行了觀察、分析、比對，以克服實驗條件和方法不同對染色體產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，云南半細毛羊綿羊的染色體2n=54，與其他綿羊的染色體相似［13-14］。

本研究初步建立了云南半細毛羊皮膚成纖維細胞系，并對其體外培養(yǎng)、生物學(xué)特性以及染色體核型分型進行了探討。該細胞系的建立對云南半細毛羊種質(zhì)資源的保存及相關(guān)繁殖生物技術(shù)研究如體細胞克隆和轉(zhuǎn)基因動物制作具有重要意義，同時對于開展其他動物成纖維細胞系的建立也有一定的理論和技術(shù)指導(dǎo)意義。

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