時(shí)間分辨熒光技術(shù)在乙型肝炎兩對(duì)半檢測(cè)中的應(yīng)用研究

杜錦池

（云南省大理州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 大理 671000）

時(shí)間分辨熒光技術(shù)在乙型肝炎兩對(duì)半檢測(cè)中的應(yīng)用研究

杜錦池

（云南省大理州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南 大理 671000）

目的 對(duì)時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（TRFIA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)乙型肝炎兩對(duì)半的測(cè)定結(jié)果的進(jìn)行比較，從而對(duì) TRFIA 在乙型肝炎兩對(duì)半測(cè)定中的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行研究。方法 以 190 例醫(yī)院患者血清樣本作為標(biāo)本，對(duì) 190 例血清樣本同時(shí)采用TRFIA 法和 ELISA 進(jìn)行乙型肝炎兩對(duì)半的測(cè)定，對(duì)計(jì)算結(jié)果符合率進(jìn)行分析比較。結(jié)果 使用 TRFIA 法和 ELISA 法測(cè)定 190 份隨機(jī)樣本HBV-M 結(jié)果符合率較高，對(duì)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)資料的 χ2檢驗(yàn)，P＞ 0.05，無(wú)顯著性差異。結(jié)論 相比于 ELISA 法，TRFIA 在對(duì)乙型肝炎兩對(duì)半的測(cè)定方面具有更強(qiáng)的特異性和更高的靈敏度，是一種比較理想可靠的臨床乙型肝炎兩對(duì)半定量檢測(cè)方法。通過(guò)使用 TRFIA 對(duì)乙型肝炎兩對(duì)半進(jìn)行定量測(cè)定，可以為乙型肝炎診斷、治療及預(yù)后提供全面及時(shí)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，為疫苗接種提供可靠依據(jù)。

TRFIA；ELISA；乙型肝炎兩對(duì)半；應(yīng)用研究

乙型肝炎兩對(duì)半是國(guó)內(nèi)醫(yī)院最常用的乙型肝炎病毒感染檢測(cè)血清標(biāo)志物，病毒免疫學(xué)標(biāo)記一共有3對(duì)，分別為HBsAg（表面抗原）和抗-HBs或HBsAb（表面抗體）；e抗原（HBeAg）和e抗體（抗HBe或HBeAb）；核心抗原（HBcAg）和核心抗體（抗HBc或HBcAb）。我國(guó)的乙型肝炎感染率在全球范圍內(nèi)是比較高的，全球約有10%及以上的人口攜帶HBsAg，乙型肝炎病毒的總感染率已經(jīng)達(dá)到33.8%～64.2%[1]。

目前國(guó)內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室最常用的乙型肝炎病毒感染者的血清學(xué)標(biāo)志物監(jiān)測(cè)主要依靠酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法，而這種方法由于受到自身局限性的限制，只能進(jìn)行定性分析不能判斷乙型肝炎兩對(duì)半具體含量，結(jié)果一般用“陽(yáng)性”或“陰性”表示。這樣的情況明顯不能滿(mǎn)足療效觀(guān)察和疫苗注射的需要。因此我們需要一種具有更高靈敏度，更加快捷的方法來(lái)彌補(bǔ)ELISA法的不足。而TRFIA法是在80年代初發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)超微量免疫分析技術(shù)，它利用了穩(wěn)定的稀土元素標(biāo)記和增強(qiáng)液的放大效應(yīng)，能夠最大限度地提高了檢測(cè)靈敏度，并且在特異性、測(cè)定穩(wěn)定性以及測(cè)量自動(dòng)化方面表現(xiàn)也較為優(yōu)越，是替代ELISA的主要分析方法之一。在本文中，筆者同時(shí)對(duì)190例血清樣本分別使用TRFIA法和ELISA法對(duì)血清標(biāo)本中的HBV含量進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)兩種方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析比較，具體測(cè)定過(guò)程和結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

檢測(cè)的乙型肝炎兩對(duì)半血清標(biāo)本均來(lái)自本院于2012年1月至8月隨機(jī)門(mén)診患者和住院患者，一共190例。收集的血清中乙型肝炎患者有118例，其中男性86例，女性32例，患者平均年齡為37.9歲，所有病例的診斷均嚴(yán)格按照國(guó)家修訂的毒性肝炎防治方案標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。另外的72例來(lái)自保健科健康體檢人群，并且已排除乙型肝炎病毒感染可能性。所有樣本人員均于早晨空腹期間采靜脈血，及時(shí)分離血清后將樣本進(jìn)行-20℃保存待測(cè)。

1.2 儀器和試劑

試劑：定性檢測(cè)采用北京科衛(wèi)臨床診斷試劑有限公司提供的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒。定量檢測(cè)采用上海新波生物技術(shù)有限公司提供的配套試劑盒。質(zhì)控物有廣州豐華生物工程有限公司提供。

儀器：酶標(biāo)儀由奧地利Sunrise公司提供的128C酶標(biāo)儀，時(shí)間分辨熒光免疫分析儀由上海新波生物技術(shù)有限公司提供，型號(hào)為EFFICUTA。

1.3 方法

同時(shí)采用TRIFA和ELISA對(duì)190例血清標(biāo)本進(jìn)行乙型肝炎兩對(duì)半測(cè)定，嚴(yán)格按照儀器及試劑操作說(shuō)明進(jìn)行操作和判斷結(jié)果。在使用ELISA法與TRFIA法測(cè)定HBV時(shí)，需嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行并同時(shí)加入相應(yīng)的質(zhì)控物監(jiān)測(cè)。

ELISA法的主要步驟：加樣，孵育，洗板，加酶或底物，顯色，比色，進(jìn)行抗乙型肝炎病毒核心抗體測(cè)定稀釋時(shí)，應(yīng)按照1∶30的比例進(jìn)行。

TRFIA法的主要步驟：加樣，振蕩，洗板。加入事先配好的標(biāo)記物工作液，再振蕩，洗板，加入增強(qiáng)液并振蕩，上機(jī)檢測(cè)，測(cè)定過(guò)程時(shí)間應(yīng)控制在30min內(nèi)。進(jìn)行抗乙型肝炎病毒核心行體測(cè)定稀釋時(shí)，所按比例為1∶30[2]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

190份隨機(jī)樣本 TRFIA和ELISA法測(cè)定結(jié)果符合率如表1。

對(duì)表1進(jìn)行觀(guān)察，我們發(fā)現(xiàn)TRFIA和ELISA兩種方法的測(cè)定結(jié)果符合率均在90%以上，且各項(xiàng)檢測(cè)項(xiàng)目的陰陽(yáng)性結(jié)果在經(jīng)過(guò)配對(duì)資料χ2檢驗(yàn)后，均無(wú)顯著性差異，P＞0.05。

3 討 論

3.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

表1 TRFIA法和ELISA法對(duì)HBV-M測(cè)定結(jié)果

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的原理為，將以酶標(biāo)記的抗體或抗原作為主要試劑，這種方法在標(biāo)記免疫技術(shù)中是最為常用的，此方法具有操作簡(jiǎn)單、方便快速以及實(shí)際有效期限較長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于大批量的樣本檢測(cè)。但是其在特異性及靈敏度方面具有一定的缺陷，容易造成漏檢或假陽(yáng)性等誤診情況的發(fā)生。且由于酶的純度反應(yīng)過(guò)程受周?chē)h(huán)境因素影響較大，因此就造成了ELISA法穩(wěn)定性較差的結(jié)果[3]。除此之外，由于ELISA檢測(cè)法只能對(duì)乙型肝炎兩對(duì)半各項(xiàng)指標(biāo)的濃度做出籠統(tǒng)的檢測(cè)，而且檢測(cè)結(jié)果只能使用陰性或陽(yáng)性表示，因此給實(shí)際臨床診斷和治療帶來(lái)諸多的不便，不是一種可靠全面的檢測(cè)方法。

3.2 時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（TRFIA）

時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（TRFIA）具有高靈敏度、零本底、試劑有效期長(zhǎng)、穩(wěn)定性好、線(xiàn)性范圍寬以及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)的集合使得它當(dāng)仁不讓地成為最具廣闊發(fā)展?jié)摿Φ男屡d生物學(xué)技術(shù)，它的產(chǎn)生為標(biāo)記免疫技術(shù)領(lǐng)域帶來(lái)了一次革新式的飛速發(fā)展。近年來(lái)該方法的不斷進(jìn)步和發(fā)展，使得其迅速取代原有方法一躍成為當(dāng)今各級(jí)醫(yī)療部門(mén)進(jìn)行乙型肝炎兩對(duì)半檢測(cè)的一種最有效的主要方法。在對(duì)大批量樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，TRFIA同樣能夠勝任并且檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

3.3 TRFIA的優(yōu)越性

TRFIA法是使用的三價(jià)稀土離子及其螯合劑作為示蹤物的，并且它使用的時(shí)間分辨熒光儀能夠?qū)r(shí)間延遲，進(jìn)而使得特異性熒光與非特異性熒光能夠很好地實(shí)現(xiàn)分離，這樣一來(lái)便可獲得準(zhǔn)確的HBV-M的具體含量，在定量檢測(cè)方面具有獨(dú)特的優(yōu)越性：①提高了乙型肝炎 HBsAg檢測(cè)靈敏度，可達(dá)0.2μg/L。傳統(tǒng)的ELISA法在乙型肝炎早期檢測(cè)HBsAg時(shí)是呈陰性的，而TRFIA能在急性乙型肝炎早期就準(zhǔn)確地檢查出 HBsAg，對(duì)是否感染HBV進(jìn)行確診，這一特點(diǎn)毫無(wú)疑問(wèn)能大大縮短按“窗口期”時(shí)間[4]。另外，病毒一旦發(fā)生變異，其表達(dá)量是很低的，使用常規(guī)的ELISA法無(wú)法測(cè)出抗原，而TRFIA法因其優(yōu)越的靈敏度能夠同時(shí)定量檢測(cè)出HBsAg和HBsAb。而且使用TRFIA法能夠?yàn)镠BsAg濃度較低的攜帶者進(jìn)行定量檢測(cè)，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行密切監(jiān)測(cè)并及時(shí)采取措施以避免其發(fā)展成為乙型肝炎或慢性病攜帶者。②為病情及藥物治療效果提供動(dòng)態(tài)觀(guān)察途徑，為醫(yī)師選藥及選擇治療方案提供科學(xué)依據(jù)。當(dāng)醫(yī)生進(jìn)行選藥時(shí)，可以使用TRFIA對(duì)患者用藥前后的血清學(xué)標(biāo)志物濃度進(jìn)行檢測(cè)，以獲得準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果，醫(yī)生便可以更具實(shí)際的療效大小為患者提供最準(zhǔn)確適合的用藥方法。另外，TRFIA還能對(duì)HBsAg和HBsAb的濃度變化提供定量分析，為判斷急性乙型肝炎是否處于恢復(fù)期提供判斷依據(jù)。使用TRFIA定量檢測(cè)能夠?qū)⒑诵目贵w濃度反應(yīng)出來(lái)，進(jìn)而可以為醫(yī)生提供判斷病毒感染狀態(tài)的指導(dǎo)依據(jù)，這一用法可以有效地進(jìn)行抗病毒治療患者的篩選、療效觀(guān)察和停藥判斷。③在乙型肝炎預(yù)防中，TRFIA也有廣大的發(fā)揮空間，為注射乙型肝炎疫苗提供主導(dǎo)依據(jù)。當(dāng)HBsAb含量＞100mIU/mL以上時(shí)人體才具有抵抗HBV入侵的能力[4]，因此通過(guò)TRFIA進(jìn)行定量檢測(cè)后，醫(yī)師可以根據(jù)人體具體情況進(jìn)行乙型肝炎疫苗注射工作。

通過(guò)對(duì)TRFIA和ELISA二者方法的實(shí)際研究比較，筆者認(rèn)為，TRFIA法因其獨(dú)特的靈敏度和穩(wěn)定度等優(yōu)勢(shì)，必將受到廣大醫(yī)患雙方的歡迎和認(rèn)可，進(jìn)而成為正常人群對(duì)自身乙型肝炎病毒進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和預(yù)防接種的首選，也會(huì)成為乙型肝炎臨床治療動(dòng)態(tài)觀(guān)察的主要方法。

[1]段正軍,徐杰.兩種方法對(duì)比檢測(cè)乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2007,4(7):636.

[2]張紅珊.時(shí)間分辨熒光技術(shù)在乙肝病毒標(biāo)志物定量檢測(cè)中的應(yīng)用[J].醫(yī)技與臨床,2009(5):98.

[3]周智,劉祀.乙型肝炎病毒標(biāo)志物低水平復(fù)制的檢測(cè)及方法學(xué)比較[J].中華肝臟病雜志,2007,2(2):13.

[4]任建新.時(shí)間分辨熒光免疫法定量檢測(cè)乙肝兩對(duì)半的效果評(píng)價(jià)[J].中外醫(yī)療,2010,29(13):98.

R512.6+2；R446.1

：B

：1671-8194（2013）07-0202-03