赤子愛勝蚓中溶栓成分的提取分離與純化

李 鵬

（沈陽市蘇家屯區(qū)中興街道中興社區(qū)衛(wèi)生服務中心，遼寧 沈陽 110102）

赤子愛勝蚓中溶栓成分的提取分離與純化

李 鵬

（沈陽市蘇家屯區(qū)中興街道中興社區(qū)衛(wèi)生服務中心，遼寧 沈陽 110102）

本文通過對赤子愛勝蚓（Eisenia foelide）的溶栓成分的跟蹤，確定出赤子愛勝蚓中活性成分的提取、分離、純化的方法。首先5 倍量生理鹽水提取 3 次，每次 2h。純化方法是組織勻漿用硫酸銨分段鹽析后沉淀用 20mM（pH8.0）Tris-Hcl緩沖液透析后經(jīng) DEAE SepHadex A-25 柱過濾，得到活性組分，再經(jīng)柱過濾，用凝膠電泳測其分子量為 25KD 和 30KD。

赤子愛勝蚓；溶栓成分；提??；分離；純化

近年來，對地龍體內(nèi)溶栓成分的研究非常踴躍?，F(xiàn)知的地龍溶栓成分有：地龍纖維蛋白溶纖酶、蚓激酶和蚓膠原酶三種酶系[1,2]，其中蚓激酶的溶栓成分為多種水溶性蛋白質(zhì)。性質(zhì)穩(wěn)定可在常溫下操作[3]。本文對赤子愛勝蚓中有效成分的提取條件進行了探索并用層析技術(shù)對其進行了純化。由于親和層析操作簡單，分離快，因此為純化其溶栓成分有效的方法之一。

1 儀器與設備

1.1 儀器

JY99-Ⅱ超聲波細胞粉碎機；FD-3-55D-MP臺式冷凍干燥機；透析袋；AKTA（瑞士，帶有紫外檢測儀）；BIO-RADPAC300電泳儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 試劑

尿激酶（UK）標準品，800單位/支，批號：200415，中國藥品生物制品檢定所；纖維蛋白原，批號：140607-200434，中國藥品檢定所；DEAE SepHadex A-25為pHarmacia產(chǎn)品；雙丙烯酰胺（Bis）Fluka chemic AG CH-9470.Buchs；三羥甲基氨基甲烷（Tris），批號：2002.1025，中國醫(yī)藥集團；甘氨酸批號：2001211，上?？颠_；其他均為國產(chǎn)分析純。

2 實驗方法

2.1 赤子愛勝蚓提取溶劑的確定

2.1.1 赤子愛勝蚓溶栓活性成分提取

將赤子愛勝蚓用清水浸泡后，取三等份量的赤子愛勝蚓，分別用8倍量的0.02mol/L PBS溶液、8倍量的生理鹽水和8倍量20%乙醇溶液于組織搗碎機勻漿10min，再用超聲波粉碎10min，于4℃下離心至澄清，澄清液加入3倍量的丙酮，邊攪拌，靜置12h，過濾得沉淀用丙酮脫水，室溫揮干，即得干粉。

2.1.2 尿激酶瓊脂糖——纖維蛋白平板法測定活性

2.1.2.1 試劑配制：①配制0.01mol/L pH7.75磷酸鹽緩沖液；②工作液：取磷酸鹽緩沖液與0.9%氯化鈉溶液1∶17稀釋③配制1%瓊脂糖液；④配制0.3%纖維蛋白原液；⑤配制1BP單位濃度的凝血酶液。

2.1.2.2 鋪板。

2.1.2.3 標準品溶液的配置。

2.1.2.4 樣品溶液的配制：分別取樣品1mg，各加入2mL 0.9%Nacl溶液溶解。

2.1.2.5 測定方法：分別吸取尿激酶標準溶液及樣本溶液10μL，加在平板上，37℃放置18h，取出，用卡尺測量溶圈的垂直兩直徑，在對數(shù)紙上繪制標準曲線，計算樣品效價結(jié)果。

2.2 赤子愛勝蚓中溶栓成分提取工藝的確定

按《生物制品化學及其他檢定方法》中蛋白含量測定項下lowry法來測定每份蛋白含量，結(jié)果見表1。

表1 lowry法測定每份蛋白含量的結(jié)果

2.3 赤子愛勝蚓中溶栓成分的分離純化和分子量的測定

2.3.1 將蚯蚓洗凈，按上述方法加入五倍量的生理鹽水，初提掖。其中加入固體硫酸銨達30%飽和度，置冰箱中于4℃冷藏過夜。次日，以10000轉(zhuǎn)/分，4℃離心10min，上清液中加入固體硫酸銨達60%飽和度，置冰箱中于4℃冷藏過夜。棄上清液，沉淀用0.02mol/L pH8.0 Tris-Hcl緩沖液溶解，透析后吸附在DEAE SepHadex A-25離子交換凝膠柱上，用0.02mol/L PH8.0 Tris-Hcl（Nacl濃度從0.0～0.5mol/L）進行洗脫，紫外檢測，收集活性液。活性洗脫液透析后上Benzamidine SepHarose 6B凝膠柱，并用緩沖液洗脫后，用含0.5mol/L精氨酸（argine）的20mM NaAc（PH5.0）洗脫，收集活性峰，活性洗脫液透析后冷凍干燥保存。

2.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定樣品分子量和純度

2.3.2.1 試劑配制：Ⅰ配制丙烯酰胺-雙丙烯酰胺儲備溶液；Ⅱ配制PH8.8三羥甲基氨基甲烷緩沖液；ⅢpH6.8三羥甲基氨基甲烷緩沖液；Ⅳ10%十二烷基硫酸鈉溶液；Ⅴ供試品緩沖液。

2.3.2.2 凝膠的配制：①制備分離膠；②制備濃縮膠；③制備標準蛋白溶液；④配供試品溶液。

2.3.2.3 測定方法：分別加入10μL的供試品標準蛋白，倒入電級緩沖液，200伏電壓下進行電泳，當藍色溴酚藍接近膠板底部時，停止電泳，取消膠板，在溴酚藍處做標記。將膠板置于固定液中30min，取出置于37℃染色液中2、3h，然后置于脫色液中，至背景清晰。

3 結(jié)果與討論

3.1 赤子愛勝蚓中抗凝成分提取溶劑的確定實驗結(jié)果見表2。

表2 赤子愛勝蚓中抗凝成分提取溶劑的確定實驗結(jié)果

從上述結(jié)果看出，對于赤子愛勝蚓的初提溶劑，磷酸鹽、低濃度乙醇、生理鹽水對提取干粉的重量并無明顯差異。

3.2 尿激酶瓊脂糖——纖維蛋白平板法測定活性，結(jié)果見表3。

3.3 樣品測定，結(jié)果見表4。

從以上兩表結(jié)合看，三種溶劑對提取的活性并無明顯差異，故擬定以生理鹽水提取。

表3 尿激酶瓊脂糖——纖維蛋白平板法測定活性結(jié)果

表4 樣品測定結(jié)果

3.4 赤子愛勝蚓提取工藝確定實驗結(jié)果見表5。

表5 正交實驗結(jié)果

3.5 方差分析表，結(jié)果見表6。

表6 方差分析表

從結(jié)果可以看出，影響的主要因素是提取次數(shù)、加生理鹽水量和提取時間。最佳的提取條件為A3B2C3，即以5倍量的生理鹽水，提取3次，每次2h。

3.6 赤子愛勝蚓中抗凝成分中溶栓成分的分離純化和分子量的測定實驗結(jié)果

3.6.1 溶栓成分得到分離純化。

3.6.2 分子量和純度：從SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜可以看出，前面所得到的活性組分為分子量25KD和30KD的兩個組分，且純度較高。

[1]徐鳳彩,高向陽,王煒軍,等.蚯蚓體內(nèi)營養(yǎng)和藥物優(yōu)秀成分的研究進展[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報,2001,22(3):86-89.

[2]任仁安.中藥鑒定學[M].上海:上?？茖W技術(shù)出版社,1986:408-409.

[3]程牛亮,王亞新,鄭國平,等.雙胸蚓纖溶酶II的純化及其性質(zhì)的研究[J].中國實驗臨床免疫學雜志,1996,8(2):8-10.

R284.2

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：1671-8194（2013）07-0093-02