復(fù)肝口服液中大黃素含量的RP-HPLC法檢測(cè)

李耀興

（吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院，吉林 吉林 132021）

復(fù)肝口服液中大黃素含量的RP-HPLC法檢測(cè)

李耀興

（吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院，吉林 吉林 132021）

目的 探究復(fù)肝口服液中大黃素含量的檢測(cè)辦法——反相高效液相色譜法實(shí)驗(yàn)測(cè)試。方法 按照以下標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行本次試驗(yàn)，要求色譜柱為 TB-C18 （160mm×513mm，6μm），甲醇 -0.2% 磷酸（80 ∶ 19），檢測(cè)波長(zhǎng)為 530nm，柱溫為 40℃，流速為 2.0mL/S。結(jié)果 大黃素的樣本標(biāo)準(zhǔn)容量為 0.08652-0.12570mg，在這個(gè)有限范圍內(nèi)的函數(shù)回歸關(guān)系（r=0.8976），平均回收率為 99.36%，RSD=1.021%（n=6）。結(jié)論 本文介紹的檢測(cè)辦法簡(jiǎn)單易操作、快捷、效果良好，符合國(guó)家藥品管理復(fù)肝口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

大黃素含量；復(fù)肝口服液；反相高效液相色譜法

復(fù)肝口服液的主要藥物成分是柴胡、當(dāng)歸、白芍、茯苓、白術(shù)、黃芪、枸杞子、女貞子、菟絲子、何首烏等名貴中草藥，它的功效主要是抗病毒、提高人體免疫力、增強(qiáng)肝腎排毒功能、促進(jìn)人體吸收消化[1]，在臨床上主要用于治療病毒性乙型肝炎和丙型肝炎?；⒄冗@一味藥是復(fù)肝口服液的主要成分，而大黃素則是虎杖的重要活性組成部分，所以我們選取了大黃素作為檢測(cè)復(fù)肝口服液是否合格的指標(biāo)，用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法檢測(cè)定大黃素的成分及含量，這個(gè)方法方便、快捷、安全系數(shù)高，是值得信賴的好產(chǎn)品。

1 實(shí)驗(yàn)資料

為了保障實(shí)驗(yàn)的可靠程度高，收集的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確無(wú)誤，我們?cè)谶x用儀器設(shè)備上也要精益求精。本次實(shí)驗(yàn)儀器主要是1200型HPLC儀，包括G2170AB型PC化學(xué)工作站、G2311A型梯度泵、G2314A型紫外檢測(cè)器；AX-200型電子天平；SQ250DD型數(shù)控超聲波清洗器。試用藥品是甲醇（色譜純）和重蒸餾水，至于其他的試劑都必須是分析純。所有的實(shí)驗(yàn)所需的物料都已經(jīng)準(zhǔn)備完善了，下面我們會(huì)詳細(xì)介紹試驗(yàn)方法和步驟。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜標(biāo)準(zhǔn)

我們嚴(yán)格要求色譜柱TB-C18（160mm×513mm，6μm），甲醇-0.2%磷酸（80∶19），檢測(cè)波長(zhǎng)為530nm，柱溫為40℃，流速為2.0mL/s。此時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照品的曲線圖里大黃素與分色譜線呈現(xiàn)出交叉垂直，而大黃素與樣品中的色譜基線相分離，出現(xiàn)兩個(gè)高峰的位置，陰性對(duì)照在大黃素色譜峰位置處沒(méi)有錯(cuò)峰出現(xiàn)，保持5min時(shí)間。

2.2 溶液試劑的準(zhǔn)備

下面我們簡(jiǎn)單介紹一下對(duì)照品溶液的制作過(guò)程：首先取出對(duì)照品400mg大黃素，放在300mL的玻璃量杯中，加少量甲醇溶液，手動(dòng)搖勻稀釋對(duì)照品溶液至濃度為19.12μg/mL。

供試品溶液的制備：取出樣品30mL，將其放在60mL圓底燒瓶中，加濃度為2.45mol/L的硫酸15mL，然后加適量的水讓其過(guò)濾，濾液移入分液漏斗中，加三氯甲烷萃取20mL/次，一共萃取3次，最后把所有萃取液合攏回收，蒸干萃取液，把剩余的殘?jiān)尤爰状既芙獠⑥D(zhuǎn)移到5mL量杯中，搖勻，用0.4μm的微孔過(guò)濾膜即得到試驗(yàn)品溶液。

緊接著我們把陰性對(duì)照溶液的制作方法做一下簡(jiǎn)單的了解：按照事先計(jì)算好的溶液比例和生產(chǎn)制作工藝制備不含虎杖的陰性樣品溶液，必須采用專業(yè)的方式方法制備陰性對(duì)照溶液，大膽細(xì)心的分離出對(duì)照品溶液中的大黃素成分，并且按照色譜條件測(cè)定高峰面積，還要引用數(shù)學(xué)中的微積分，進(jìn)行線性回歸的假設(shè)，得出一個(gè)線性回歸方程為Y=2321.16536X-3.3452 （r=0.198789）。計(jì)算結(jié)果表明，峰面積積分值的大小與大黃素樣本容量在0.06785-0.37865mg的范圍內(nèi)的數(shù)學(xué)關(guān)系出現(xiàn)令人欣慰的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：我們吸取對(duì)照品溶液10μL，按照以上的色譜標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次，測(cè)試后的峰面積的平均積分值為435.649，RSD=0.356%（n=5），這就說(shuō)明儀器的精密度十分穩(wěn)定，便于工作人員的操作。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：我們選擇在第2、4、6、8、10h分別測(cè)試相同的一組供試品溶液，我們隨機(jī)抽取了10μL樣品溶液，測(cè)試結(jié)果中的峰面積平均積分值為398.358，RSD=0.98%，我們可以得出的結(jié)論是供試品溶液至少在這10h內(nèi)的化學(xué)性質(zhì)是十分自然和穩(wěn)固的，不需要實(shí)驗(yàn)人員的額外關(guān)注。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：我們選取同一批樣品溶液，按照1∶1的比例進(jìn)行試供品溶液的集體分發(fā)，在5份供試品溶液中我們按照色譜條件的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)建立測(cè)試檔案，結(jié)果顯示為大黃素的平均含量為4.231mg/mL，RSD=0.99%，這說(shuō)明了試樣結(jié)果很符合之前的猜想。

加樣回收率試驗(yàn)：取已知含量的樣品30mL共5份，置于圓底燒瓶中，分別加入對(duì)照品溶液17.68μg/mL 4、5、6mL，我們把供試品溶液按上述色譜條件測(cè)定后的結(jié)論加以整合，得出的樣回收率，具體結(jié)果可以見(jiàn)表1。

表1 樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=8）

樣品含量檢測(cè)：我們選擇了3個(gè)不同生產(chǎn)批次的復(fù)肝口服液，每次隨機(jī)抽取20mL，并且按照科學(xué)有效的方法制造供試品溶液，取15mL進(jìn)入樣本溶液，按照上文提到的方式-色譜條件標(biāo)準(zhǔn)法來(lái)監(jiān)測(cè)出峰面積，然后根據(jù)既定的回歸方程式計(jì)算出大黃素的真實(shí)含量，最終這3批樣品的綜合含量為5mg/mL（n=4）；RSD的值分別為0.13%、0.19%、0.23%。

3 討 論

我們?cè)谔剿魉崴饩_時(shí)間時(shí)是這樣做的：取4份樣品溶液，每一份都是30mL，分別放置在50mL圓底燒杯中，然后再往燒杯里添加200mol/L的硫酸15mL，進(jìn)行水浴回流1、2、3h，過(guò)濾后，將濾液用氯仿萃取4次，每次15mL，合并所有的萃取液，降低壓力讓其快速蒸發(fā)干凈，最后添加4mL甲醇溶解和過(guò)濾，經(jīng)過(guò)短暫的沉靜，就可以用儀器檢測(cè)出大黃素的實(shí)際含量。結(jié)論是酸水解時(shí)間分別為第1、2、3h時(shí)，對(duì)應(yīng)的樣品含量分別為3245、4067、4213mg/mL，這就說(shuō)明酸水解1h即可[2]。在研究三氯甲烷需要多少萃取次數(shù)時(shí)，我們是這樣嘗試的取出樣本溶液4份，每一份都是15mL，分別倒入60mL圓底燒瓶中，增加230mol/L的硫酸15mL，經(jīng)過(guò)1h水浴回流后，過(guò)濾，濾液要經(jīng)過(guò)氯仿萃取多次，每次15mL，然后將萃取液降低壓力至完全脫水，加少量甲醇溶解，過(guò)濾，提取第4次時(shí)，對(duì)應(yīng)的樣品含量分別為4231、432、4150mg/mL，說(shuō)明提取4次后就已經(jīng)將大黃素完全提取出來(lái)了[3]。在試驗(yàn)中曾經(jīng)采用不同長(zhǎng)度的C18色譜柱比較分離效果，結(jié)果采用TB-C18分離效果是最好的，不僅等待的時(shí)間最短，而且大黃素的提取含量也是最高的。在可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器上檢測(cè)出了很多不同的數(shù)據(jù)，但是相對(duì)集中的數(shù)據(jù)是245、289、440、429nm這四個(gè)波長(zhǎng)，在研究相對(duì)集中的波短下的樣品圖譜，結(jié)果最終選擇430nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，不僅圖譜的圖形清晰明了，準(zhǔn)確度也提高了許多。流動(dòng)相中這二者的浮動(dòng)比例進(jìn)行多次篩選，我們決定選用甲酸-0.11%磷酸，因?yàn)樵谶@個(gè)比例上大黃素與雜質(zhì)的分離效果是比較接近實(shí)際的。

[1]國(guó)家 藥典 委員會(huì) 編.中華人民 共和國(guó)藥典 (一 部 )[S].北 京:化 學(xué)工業(yè)出版社,2005:附錄331.

[2]鄭鳳 庚.反 相 高 效 液相色譜 法測(cè)定明 珠口服液中 大 黃 素 的 含 量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2001,12(5):3921.

[3]陳 娜 娜.高 效 液相色譜 法測(cè)定常通口服液中大 黃 素的含 量[J].中國(guó)藥房,2003,14(5):2961.

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