肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)對(duì)肝細(xì)胞癌組織中缺氧誘導(dǎo)因子1α 及Foxp3 表達(dá)的影響及意義

宋浩 于友濤 何東風(fēng) 李倩

宋浩, 于友濤, 何東風(fēng), 等. 肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)對(duì)肝細(xì)胞癌組織中缺氧誘導(dǎo)因子1α 及Foxp3 表達(dá)的影響及意義[J/CD].中華介入放射學(xué)電子雜志, 2013, 1(2): 78-81.

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）起病隱匿，進(jìn)展快。很多患者就診時(shí)已經(jīng)是癌癥晚期，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（transcatheter arterial chemoembolization,TACE）是非手術(shù)治療的首選方法，其近期效果得到了普遍的認(rèn)可，并且為部分患者爭(zhēng)取到根治性治療的機(jī)會(huì)，但是遠(yuǎn)期療效并不令人滿意[1]。惡性腫瘤的發(fā)生原因之一是腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）在免疫耐受中影響免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤抗原的應(yīng)答，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。而Foxp3是CD4+CD25+Treg 發(fā)育和功能的決定因素，是CD4+CD25+Treg 的特異標(biāo)志[3]。同時(shí)，有相關(guān)文獻(xiàn)指出局部缺氧能促進(jìn)Foxp3 的表達(dá)，并且被認(rèn)為是缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1α）起著重要的作用[4-5]。本研究的目的是探討經(jīng)過(guò)TACE 治療后的肝細(xì)胞癌殘癌組織中HIF -1α 對(duì)腫瘤局部免疫微環(huán)境的影響，為改善腫瘤預(yù)后提供新的思路。

材料與方法

一、材料

收集2002 年1 月—4 月，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院介入科行TACE 術(shù)后Ⅱ期手術(shù)切除的HCC 患者組織標(biāo)本31 例（TACE 治療組）。選取同期未經(jīng)過(guò)任何治療直接行手術(shù)切除HCC 患者的組織標(biāo)本37 例（單純手術(shù)組）。TACE 治療組患者手術(shù)前接受1～4 次的TACE 治療，其中19例≤2 次，5 例＞2 次，平均1.7 次/例。TACE術(shù)中藥物及栓塞材料包括表柔比星20～40 mg、絲裂霉素10～20 mg、羥喜樹堿5～20 mg、氟尿苷250～1000 mg、碘油10～30 ml、明膠海綿碎屑。末次TACE 到Ⅱ期手術(shù)切除間隔時(shí)間為13～226 d，平均22.1 d。兩組患者在年齡、性別、有無(wú)肝硬化病史、病灶大小、病灶數(shù)目、AFP 值及肝功能Child-Pugh分級(jí)方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

二、方法

1.檢測(cè)方法

（1）主要試劑：HIF-1α 單克隆抗體（型號(hào)ZM-0342）、兔抗人Foxp3 單克隆抗體（型號(hào)ZM-0436）、抗兔免疫組化SP 試劑盒（編號(hào)SP-9001）、DAB 顯色試劑盒（編號(hào)ZLI-9017）、APES 防脫片劑（編號(hào)ZLI-9003）、PBS 緩沖液（編號(hào)ZLI-9063），均購(gòu)自北京中杉金橋生物公司。

（2）切片準(zhǔn)備：每個(gè)肝癌組織蠟塊標(biāo)本厚4 μm，連續(xù)切片3 張。

（3）免疫組織化學(xué)染色：用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的聯(lián)酶卵白素染色法（SP 法），常規(guī)脫蠟水化，組織抗原高壓蒸汽修復(fù)。PBS 清洗后滴加一抗（用來(lái)檢測(cè)HIF-1α 的組織切片滴加一抗前需經(jīng)10%山羊血清封閉）。于4℃冰箱中過(guò)夜后，置室溫下20 min，沖洗，DAB 染色，蘇木精復(fù)染。封存固定。每組用已知陽(yáng)性作對(duì)照，以PBS 代替一抗做陰性對(duì)照。

2.結(jié)果分析：光鏡下HIF-1α 以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核有棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色。高倍鏡（×200）下分別選取陽(yáng)性染色最明顯的5 個(gè)視野，每個(gè)視野統(tǒng)計(jì)200 個(gè)細(xì)胞，共1 000 個(gè)細(xì)胞。計(jì)算每張切片陽(yáng)性細(xì)胞百分率，分4 級(jí)：≤10%為0，11%～25%為＋，26%～50%為＋＋，＞50%為＋＋＋。本研究規(guī)定切片陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤25%為陰性。Foxp3蛋白表達(dá)為藍(lán)紫色顆粒。以Foxp3+淋巴細(xì)胞數(shù)量作為組織中Treg 數(shù)量。每張切片取5 個(gè)高倍視野（×400），定性標(biāo)準(zhǔn)參照HIF-1α 的定性辦法。

3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：使用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗(yàn)（必要時(shí)使用Fisher 精確概率檢測(cè)法）。計(jì)量資料以±s表示；HIF-1α、Foxp3 的相關(guān)性分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組標(biāo)本HIF-1α 蛋白及Foxp3 表達(dá)情況（表1，圖1、2）

TACE 治療組肝癌組織標(biāo)本中HIF-1α 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率平均為90.3%，較單純手術(shù)組（6.6%）高，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.785，P＜0.05）。TACE 治療組肝癌組織標(biāo)本中Foxp3 蛋白表達(dá)平均為87.3%，高于單純手術(shù)組（65.4%），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.399，P＜0.05）。

表1 兩組肝細(xì)胞癌患者HIF-1α 和Foxp3 表達(dá)的比較[例數(shù)，百分率（%）]

二、TACE 治療組殘癌組織中HIF-1α 與Foxp3蛋白陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)情況

在TACE 治療組中，HIF-1α 蛋白陽(yáng)性表達(dá)與Foxp3 蛋白陽(yáng)性表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.537，P=0.006）。

圖1 TACE 組術(shù)后殘癌組織（A）及單純手術(shù)組切除肝細(xì)胞組織（B）HIF-1α 蛋白表達(dá)（SP，×400）圖2 TACE 組術(shù)后殘癌組織（A）及單純手術(shù)組切除肝細(xì)胞組織（B）Foxp3 表達(dá)（SP，×400）

討 論

楊秀華等[6]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤周圍肝組織中CD4+CD25+Treg含量明顯高于腫瘤及正常肝臟組織，并且隨著CD4+CD25+Treg 的增加，CD8+T 淋巴細(xì)胞出現(xiàn)減少的趨勢(shì)。Treg 能夠通過(guò)抑制CD8+T 細(xì)胞對(duì)白細(xì)胞介素2 基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，來(lái)抑制T 淋巴細(xì)胞的活化與增殖，從而使局部微環(huán)境呈免疫抑制狀態(tài)。而且這種抑制作用是通過(guò)細(xì)胞的直接接觸或細(xì)胞因子而作用，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與預(yù)后成負(fù)性相關(guān)[7]。Jones 等[8]采用anti-CD25mAb去除調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞以抑制惡性黑色素瘤生長(zhǎng)，證明CD4+CD25+Treg 在人類腫瘤微環(huán)境下通過(guò)對(duì)CD8+T 淋巴細(xì)胞的抑制參與了腫瘤的免疫抑制，通過(guò)去CD4+CD25+Treg，可以解除其對(duì)免疫細(xì)胞的抑制作用。

腫瘤內(nèi)各種炎性細(xì)胞相互作用可促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展。TACE 可造成腫瘤細(xì)胞缺血、缺氧致壞死，同時(shí)也增加了局部腫瘤組織炎性介質(zhì)的釋放。在治療HCC 的同時(shí)，TACE 對(duì)機(jī)體免疫功能的影響不容忽視[9]。至于對(duì)Treg 的鑒定，F(xiàn)oxp3 得到了較多的認(rèn)可。鄭啟昌等[10]研究發(fā)現(xiàn)Foxp3 蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)與CD4+CD25+Treg 變化相平行，并且是其發(fā)育和功能的決定因素，被認(rèn)為是CD4+CD25+Treg 的特異標(biāo)志[3]。在試驗(yàn)中，通過(guò)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TACE 術(shù)后Ⅱ期切除殘癌組織，顯示TACE 治療組Foxp3 表達(dá)高于單純手術(shù)組（P＜0.05）。所以，這可能是造成TACE 治療HCC 遠(yuǎn)期效果不令人滿意的原因之一。而Xiong等[11]在對(duì)TACE 術(shù)前、術(shù)后外周血中的Treg 進(jìn)行比較分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)TACE 術(shù)前、術(shù)后患者外周血中Treg 均高于健康人，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是由于TACE 所致腫瘤局部缺氧而Treg 在局部增多，由于血流的阻斷，不能與外周血溝通，從而對(duì)外周血中的Treg 影響較小。但項(xiàng)研究同時(shí)指出，TACE 術(shù)后1 個(gè)月的血中Treg 水平可以對(duì)HCC 預(yù)后進(jìn)行判斷，這可能是由于新生血管形成，使局部CD4+CD25+Foxp3+Treg 部分釋放至外周血。而本試驗(yàn)中TACE 術(shù)后再行切除手術(shù)的間隔時(shí)間平均為22.1 d。所以這兩項(xiàng)研究結(jié)果并不矛盾。

由此可見(jiàn)，Treg 對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的影響，是判斷HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立因素。目前對(duì)Foxp3 及Treg 高表達(dá)原因的研究較少。陳瑞清等[12]用線栓大鼠大腦中動(dòng)脈的方法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)腦缺血大鼠外周血中表達(dá)CD4+CD25+Treg，并且腦組織中也有Foxp3 的表達(dá)。而對(duì)照組（假手術(shù)組）的大鼠大腦中無(wú)Foxp3 表達(dá)，即便在手術(shù)組的大鼠中，未缺血側(cè)也僅有少量Foxp3 表達(dá)。這說(shuō)明缺血是Foxp3 及CD4+CD25+Treg 始動(dòng)因素之一。缺血必然伴隨著局部組織缺氧，而在實(shí)體腫瘤中，缺血缺氧是一個(gè)普遍存在的現(xiàn)象。腫瘤局部組織在缺氧環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)缺氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)發(fā)生了改變，TACE 無(wú)疑使腫瘤局部微環(huán)境中的氧含量進(jìn)一步降低。

HIF-1 是調(diào)節(jié)細(xì)胞缺氧的一個(gè)重要因子，主要由HIF-1α 和HIF-1β 兩種亞基組成。在含氧量正常的組織中，因?yàn)榻M織可降解HIF-1α，HIF-1α維持在一個(gè)較低的水平；而組織缺氧可破壞這種機(jī)制，使HIF-1α 的降解便受到影響，導(dǎo)致組織中HIF-1α 的含量提高。HIF-1α 是主要的氧調(diào)節(jié)亞基，介導(dǎo)缺氧反應(yīng)元件的調(diào)控，使得缺氧反應(yīng)元件的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，表達(dá)產(chǎn)物增多，可產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)。并且HIF-1α 對(duì)免疫微環(huán)境的影響，已經(jīng)有過(guò)相關(guān)報(bào)道。但是多為體外細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)。Ben-Shoshan 等[13]用體外培養(yǎng)細(xì)胞的方法研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 可以通過(guò)激活和促使Treg 增殖，來(lái)促使局部免疫抑制的形成。在T 細(xì)胞中，HIF-1α 可以負(fù)向調(diào)節(jié)小鼠CD4+和CD8+T 細(xì)胞，敲除HIF-1α基因小鼠的T 細(xì)胞明顯呈增殖狀態(tài)[14]，這說(shuō)明HIF-1α 是造成免疫抑制的因素之一，但具體機(jī)制尚未闡述。前文述及Treg 細(xì)胞也能夠抑制CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞的活化與增殖，而這兩種抑制作用是否直接關(guān)聯(lián)鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，TACE治療組HIF-1α 及Foxp3 均高于單純手術(shù)治療組（P ＜0.05）。并且TACE 治療組HIF-1α 與Foxp3表達(dá)水平呈正相關(guān)。這一結(jié)果為上述兩種免疫抑制作用之間建立了部分聯(lián)系。

綜上所述，TACE 在栓塞HCC 供血?jiǎng)用}使其缺血壞死、限制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)，腫瘤局部微環(huán)境也發(fā)生了十分復(fù)雜的變化，促使多種因子表達(dá)水平上調(diào)[15]，也使局部病灶HIF-1α 及Foxp3 的表達(dá)水平上調(diào)，促進(jìn)了CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的增殖與活化，抑制免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的監(jiān)視、清除、抑制等作用，從而影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。針對(duì)HIF-1α 及Foxp3 的靶點(diǎn)藥物結(jié)合介入治療可能改善TACE 術(shù)的預(yù)后，為HCC 以TACE 為主的綜合治療提供了新的思路。

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