BrdU免疫熒光染色方法的改進(jìn)

楊 燕嚴(yán)小新李 明鄧思浩薛志琴李志遠(yuǎn)*

（1 中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)系，湖南 長沙 410013；2 湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411100；3 長治醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，山西 長治 046000）

BrdU免疫熒光染色方法的改進(jìn)

楊 燕1,2嚴(yán)小新1李 明3鄧思浩1薛志琴1李志遠(yuǎn)1*

（1 中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)系，湖南 長沙 410013；2 湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411100；3 長治醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，山西 長治 046000）

目的 探索一種能確保 BrdU 與其他標(biāo)志物免疫熒光染色順利進(jìn)行的方法。方法 本實(shí)驗(yàn)采用三種不同的過酸方法來進(jìn)行 BrdU 免疫熒光染色：即①傳統(tǒng)染色法；②過酸提前法；③室溫過酸法。采集圖像，觀察三種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。結(jié)果 ①傳統(tǒng)染色法：BrdU 陽性標(biāo)記定位明確，與之雙標(biāo)的標(biāo)志物 DCX 亦可正常顯色，但核酸染料 bisbenzimide 卻未能正常顯色；②染色提前法：BrdU與 DCX 均可正常顯色，而 bisbenzimide 顯色不穩(wěn)定；③室溫過酸法：BrdU 與 DCX、bisbenzimide 均能正常顯色，且熒光亮度適中，效果理想。結(jié)論 室溫過酸法能確保 BrdU 與其他標(biāo)志物雙標(biāo)正常顯色，同時(shí)又能保證用來明確 BrdU 處理過的活細(xì)胞增殖狀態(tài)的 bisbenzimide染料正常顯色，是目前一種較好的能夠辨別 BrdU 假陽性的免疫熒光染色方法。

BrdU bisbenzimide；免疫熒光染色

5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）為胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，在細(xì)胞周期的S期DNA合成過程中整合到細(xì)胞核內(nèi)，只要細(xì)胞不凋亡，BrdU將永久地存留在細(xì)胞核DNA中，并能通過免疫組織化學(xué)方法檢測到，可用于標(biāo)記BrdU暴露期間進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞，故BrdU是反應(yīng)在體腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的一個(gè)非?？煽康臉?biāo)志物，目前廣泛應(yīng)用于神經(jīng)再生領(lǐng)域的研究[1,2]。

圖1 傳統(tǒng)染色法免疫熒光染色[傳統(tǒng)染色法：BrdU（紅色）、DCX（綠色）和bisbenzimide（藍(lán)色）免疫熒光染色?？梢夿rdU（A，→）和DCX（B，→）陽性細(xì)胞，但未見bisbenzimide（C）陽性細(xì)胞，只可見BrdU和DCX雙標(biāo)結(jié)果（D）(40×10)]

圖2 過酸提前法免疫熒光染色[過酸提前法：BrdU（紅色）、DCX（綠色）和bisbenzimide（藍(lán)色）免疫熒光染色?？梢夿rdU（A）、DCX（B）陽性細(xì)胞，也可見bisbenzimide（C）陽性細(xì)胞，但熒光亮度偏暗，且不穩(wěn)定，同時(shí)可見BrdU、DCX和bisbenzimide三標(biāo)結(jié)果（D）(40×10)]

圖3 室溫過酸法免疫熒光染色[室溫過酸法：BrdU（紅色）、DCX（綠色）和bisbenzimide（藍(lán)色）免疫熒光染色?？梢夿rdU（A）、DCX（B）陽性細(xì)胞，也可見bisbenzimide（C）陽性細(xì)胞，且熒光亮度適中，結(jié)果穩(wěn)定，同時(shí)可見BrdU、DCX和bisbenzimide三標(biāo)結(jié)果（D，→），能見到BrdU和bisbenzimide的熒光淬滅現(xiàn)象(40×10)]

二聯(lián)苯亞胺（bisbenzimide）是一種體外活性的與DNA小溝（minor groove）結(jié)合的染料，作為核酸染料，它可通過細(xì)胞膜與DNA結(jié)合，并可被紫外光及大多數(shù)熒光光源激發(fā)，比較適用于與其他紫外光激發(fā)的熒光染料一起作多重?zé)晒鈽?biāo)記，目前已被廣泛應(yīng)用[3]。這類染料中的Hoechst 33342在BrdU插入DNA的位點(diǎn)上發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象，因此可用來確定BrdU處理過的活細(xì)胞的增殖狀態(tài)，對于BrdU免疫熒光染色假陽性的現(xiàn)象具有很好的鑒別作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和實(shí)驗(yàn)動物

試劑：BrdU （B5002，Sigma-Aldrich，St Louis，MO）、BrdU單克隆抗體rat anti-BrdU （Serotec，MCA2060，1∶4000）、DCX單克隆抗體goat anti-DCX（Santa Cruz Biotech，sc-8066，diluted at 1∶2000）、熒光二抗Alexa-Fluor? 488 and Alexa-Fluor? 594 donkey anti-goat and rat IgGs （Invitrogen，Carlsbad，CA，1∶400）、Bisbenzimide（hoechst 33342）。

實(shí)驗(yàn)動物：成年豚鼠，雌雄不限，體質(zhì)量200～250g，購自中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部。

1.2 BrdU標(biāo)記

豚鼠腹腔注射BrdU，50mg/kg，注射2次，每次間隔時(shí)間為12h。繼續(xù)飼養(yǎng)7d，處死。此時(shí)BrdU參與合成的DNA多表達(dá)見于未成熟神經(jīng)元，如DCX細(xì)胞[4]。

1.3 取材和標(biāo)本處理

實(shí)驗(yàn)動物用10%水合氯醛（0.4mL/kg）麻醉，用4%多聚甲醛灌注后取腦，并將其浸泡在相同固定液中進(jìn)行后固定，置于4℃冰箱中48h。梯度蔗糖沉糖處理，從前囟后3.5～5.0mm作連續(xù)冰凍切片，厚度為6μm，貼于陽離子玻片，取24張海馬齒狀回和大腦皮層結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)完整的腦片，并確保每張腦片觀察部位大體接近，用于BrdU免疫熒光染色。

1.4 免疫熒光染色

將24張貼好的腦片隨機(jī)分為3組，采用以下3種不同的免疫熒光染色方法進(jìn)行染色。

1.4.1 傳統(tǒng)染色法

將腦片先置于formamide（甲酰胺）與SSC（枸櫞酸鈉，PH6.0）按照1∶1配好的試劑中，在65℃水浴鍋進(jìn)行抗原修復(fù)1h，自然冷卻至室溫并清洗，然后置于2N鹽酸，37℃水浴鍋中30min，使核變性，自然冷卻并清洗，再經(jīng)0.01mol/L Tris-HCL 10min，清洗后用5%驢血清封閉2h，加一抗BrdU與DCX行BrdU與DCX免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)，一抗為rat anti-BrdU和goat anti-DCX，濃度分別為1∶4000和1∶2000。4℃冰箱中孵育18h，復(fù)溫、清洗。加熒光二抗Alexa-Fluor? 488 and Alexa-Fluor? 594 donkey anti-goat and rat IgGs，濃度均為1∶400，孵育2h后清洗，加bisbenzimide（hoechst 33342）濃度為1∶50000，10min后清洗，50%甘油封片。

2N鹽酸使DNA雙鏈變性解開，Tris-HCL重建免疫組化所需的堿性環(huán)境，這樣可以很好地暴露存在于DNA雙鏈中的抗原，達(dá)到充分暴露BrdU的目的[5]。

1.4.2 過酸提前法

將腦片置于formamide（甲酰胺）與SSC（枸櫞酸鈉，PH6.0）按照1∶1配好的試劑中，在65℃水浴鍋進(jìn)行抗原修復(fù)1h，自然冷卻至室溫并清洗后，放入bisbenzimide（hoechst 33342）濃度為1∶50000，10min，然后置于2N鹽酸，37℃水浴鍋中30min，其后方法同1.4.1但由于bisbenzimide見光分解，故要求實(shí)驗(yàn)全程避光。

1.4.3 室溫過酸法

實(shí)驗(yàn)步驟同傳統(tǒng)染色法，但過2N鹽酸時(shí)，將實(shí)驗(yàn)環(huán)境從37℃水浴鍋調(diào)整為室溫（26～28℃）即可。

1.5 圖像采集

每張免疫熒光雙標(biāo)染色的切片均采用Olympus Fluoview 熒光顯微鏡在40倍鏡下定位皮質(zhì)、海馬攝片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組bisbenzimide表達(dá)情況的比較采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

采用不同的過酸方法進(jìn)行BrdU的免疫熒光染色，各組的bisbenzimide表達(dá)情況見表1，傳統(tǒng)染色法進(jìn)行免疫熒光染色，BrdU陽性標(biāo)記定位明確，與之雙標(biāo)的標(biāo)志物DCX亦可正常顯色，但核酸染料，用來明確BrdU處理過的活細(xì)胞增殖狀態(tài)的bisbenzimide卻未能正常顯色（圖1A、B、C、D）。

過酸提前法結(jié)果顯示，BrdU陽性標(biāo)記定位明確，與之雙標(biāo)的標(biāo)志物DCX亦可正常顯色，而bisbenzimide顯色不穩(wěn)定，在所做的8例切片中，僅3例有顯色，且熒光亮度偏暗，其余均無顯色（圖2A、B、C、D）。

室溫過酸法結(jié)果顯示，BrdU陽性標(biāo)記定位明確，與之雙標(biāo)的標(biāo)志物DCX亦可正常顯色，bisbenzimide也能正常顯色。在所做的8例切片中，均有著色，且熒光亮度適中，效果理想（圖3A、B、C、D）。

表1 不同過酸方法bisbenzimide表達(dá)情況的比較

3 討 論

神經(jīng)干細(xì)胞在20世紀(jì)末被發(fā)現(xiàn)以后，已逐漸成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。BrdU作為一種常用的外源性細(xì)胞增殖標(biāo)志物，方便、簡單、可靠。由于BrdU是胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，它作為DNA合成的原料摻入到細(xì)胞中，處于S期（DNA合成期）的細(xì)胞。當(dāng)有BrdU存在時(shí)，摻入到新合成的雙鏈DNA內(nèi)，以氫鏈與腺嘌呤（A）結(jié)合，有實(shí)驗(yàn)表明，只要有0.5%的胸腺嘧啶 被 BrdU 取 代 ， 就 能 用 免 疫 組 織 化 學(xué) 方 法 檢 測 出 來[6]。 然 而 由于BrdU這個(gè)抗原處于DNA雙鏈內(nèi)，使得該指標(biāo)的檢測具有特殊性，如果DNA雙鏈內(nèi)的抗原不處理，或處理不當(dāng)，將影響實(shí)驗(yàn) 結(jié) 果[7]。 因 此 在 選 擇 實(shí) 驗(yàn) 方 法 時(shí) 均 需 要 通 過 抗 原 修 復(fù)[8]， 同 時(shí)過鹽酸使核變性，再經(jīng)過Tris-HCL重建免疫組化所需的堿性環(huán)境，充分暴露BrdU。但在實(shí)驗(yàn)過程中，傳統(tǒng)方法對于免疫組織化學(xué)DAB染色沒有任何影響，但在免疫熒光染色中，卻發(fā)現(xiàn)經(jīng)37℃ 2N鹽酸處理后的切片雖有BrdU與其他雙標(biāo)的顯色，卻不能很好地完成bisbenzimide的顯色。

Bisbenzimide是屬于核酸染料，它對于明確BrdU有重要意義，可以有效防止假陽性染色的出現(xiàn)。使用鹽酸的目的是促使核變性，因此使用鹽酸對于bisbenzimide顯色是有一定影響的，然而此步驟卻又是BrdU能夠成功顯色必不可少的一步。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，通過將bisbenzimide染色提前在鹽酸之前，雖有切片能出現(xiàn)bisbenzimide顯色，但該物質(zhì)見光分解，將此步驟提前，距離實(shí)驗(yàn)結(jié)束中間步驟較多，且間隔時(shí)間較遠(yuǎn)，最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定；而室溫下（26～28℃）過鹽酸是經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，真正能既保證BrdU與其他標(biāo)志物雙標(biāo)正常顯色，又能保持bisbenzimide正常顯色的最佳方法，這對于判斷BrdU是否存在假陽性，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終的可性度具有非常重要的意義。

[1]Higuchi Y,Hattori H,Kume T,et al.Increase in nitric oxide in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain and suppression by 7-nitroindazo-le and aminoguanidine[J].Eur J Pharmacol,1998,342(1): 47-49.

[2]Seaberg RM,van der Kooy D.Adult rodent neurogenic regions: the ventricular subependyma contains neural stem cells ,but the dentate gyrus contains restricted progenitors [J].J Neurosci,2002, 22(5):1784-1793.

[3]Schnell SA,Wessendorf MW.Bisbenzimide: a fluorescent counterstain for tissue autoradiography[J].Histochemistry,1995,103(2): 111-114.

[4]Brown,JP,Couillard-Despres S,Cooper-Kuhn CM,et al.Transient expression ofdoublecortin during adult neurogenesis[J].J Comp Neurol,467(1):1-10.

[5]Shimada A,Shibata T,Komatsu K,et al.Improved methods for immunohistochemical detection of BrdU in hard tissue[J].J Immunol Methods,2008,339(1) : 11-16.

[6] 陳志宏,倪道鳳、高揚(yáng)等.流感病毒感染后小鼠嗅覺神經(jīng)元的凋亡與再生[J].中國耳鼻喉顱底外科雜志,2004,10(6) : 324-326.

[7]Mathonnet M,Lalloue F,Pettit B,et al.Differential response of olfactory neurons to axotomy at embryonic and postnatal stages [J].Neuroscience,2002,109(2) : 207-217.

[8] 王伯沄.病理學(xué)技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001: 368.

R446.6

：B

：1671-8194（2013）06-0060-03

*通訊作者：E-mail：li_zhiyuan@gibh.ac.cn