C1QBP在單核細(xì)胞THP-1趨化運(yùn)動(dòng)中的作用

岳 丹，苑 博，齊 燦，馮香梅，劉運(yùn)德，王 勇，

(1天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，天津300203;2天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院)

趨化運(yùn)動(dòng)是指細(xì)胞能夠感受到環(huán)境中化學(xué)分子的濃度梯度，并沿著濃度梯度的方向所做的定向運(yùn)動(dòng)［1］，它與機(jī)體的免疫應(yīng)答及腫瘤轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。C1QBP是一種多功能伴侶蛋白，廣泛分布于線粒體、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、高爾基體及細(xì)胞膜上，并能夠被分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中，其生理功能可能包括參與細(xì)胞內(nèi)分子運(yùn)輸、連接不同細(xì)胞器以及細(xì)胞器和細(xì)胞膜之間的信號(hào)傳導(dǎo)［2］。為探討炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制和腫瘤治療的理論依據(jù)，2011年3月～2013年6月，我們對(duì)C1QBP在單核細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細(xì)胞株 人急性單核白血病細(xì)胞(THP-1)，小鼠白血病巨噬細(xì)胞(RAW264．7)和人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù);THP-1細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基，RAW264．7和MDA-MB-231細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基。

1．1．2 試劑及抗體 Lipofectamine2000購(gòu)自 Invitrogen公司，CSF-1購(gòu)自美國(guó)BD公司，趨化小室、聚碳酸脂膜購(gòu)自Neuro Probe公司，纖連蛋白(Fibronectin)購(gòu)自Sigma公司，BCA測(cè)定試劑盒購(gòu)自Pierce公司，C1QBP抗體、PKCζ抗體、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，鬼筆環(huán)肽(phalloidin)購(gòu)自 Molecular Probe公司，蛋白A瓊脂糖(Protein A Agarose)和蛋白G瓊脂糖(Protein G Agarose)購(gòu)自Invitrogen公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1．2 方法

1．2．1 C1QBP、PKCζ在細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè) 預(yù)冷的1×SDSlysis buffer(或RIPA裂解液)裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取30μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)印法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h，兔源抗C1QBP、PKCζ、鼠源抗βactin一抗4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。

1．2．2 siRNA有效序列篩選 人 C1QBP特異性Stealth-TM RNAi由Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成。將細(xì)胞鋪于6孔板中，待細(xì)胞30% ～50%融合時(shí)，換成無(wú)雙抗無(wú)血清培養(yǎng)液。將 5μL(100 pmol)的StealthTM RNAi加入250μL的Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻;將5μL的Lipofectamine 2000加入250μL的Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻;室溫靜置孵育5 min。將上述液體混勻，室溫靜置孵育20 min;將6孔盤中的培養(yǎng)液棄去，加入1．5 mL的無(wú)雙抗含血清培養(yǎng)基;將上述混合液加入培養(yǎng)板中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1．2．3 C1QBP表達(dá)對(duì)細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)能力影響的檢測(cè) 集落刺激因子(CSF-1)用0．1%BM稀釋濃度至1、10、50、100 ng/mL，置于趨化小室的下室，30 μL/孔，只加0．1%BM的孔作為陰性對(duì)照;調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，50μL/孔，加于趨化小室的上室;將10μg/mL Fibronectin包被的5μm孔徑的聚碳酸酯膜置于趨化小室的上下室之間。趨化小室在37℃、5%CO2的孵化箱中孵育3 h;聚碳酸酯膜用PBS清洗，將沒穿過膜的細(xì)胞刮除洗掉，穿過膜的細(xì)胞固定、染色，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)，每孔至少隨機(jī)選取3個(gè)視野。

1．2．4 C1QBP表達(dá)對(duì)細(xì)胞聚合能力影響的檢測(cè)細(xì)胞提前饑餓3 h，將細(xì)胞提前鋪于6孔板中，3×105/孔，用50 ng/mL的CSF-1刺激細(xì)胞。冰PBS終止反應(yīng)，用3．7%多聚甲醛固定10 min。用含0．2%Triton X-100的F-buffer作用20 min，F(xiàn)-buffer快速洗滌。室溫下用FITC-conjugated phalloidin避光孵育細(xì)胞1 h，用F-buffer洗滌，加入甲醇萃取phalloidin，4℃萃取1 h。將甲醇吸入96孔板中，細(xì)胞用F-buffer洗滌，提取蛋白，BCA法在562 nm波長(zhǎng)下測(cè)定蛋白濃度。

1．2．5 C1QBP與PKCζ的相互作用檢測(cè) 培養(yǎng)的細(xì)胞用冰PBS洗3次，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液在冰上晃動(dòng)30 min，用細(xì)胞刮刮取，收集細(xì)胞裂解液，12 000 r/min、4℃、離心15 min。每管吸取上清液50～100μL作為Input。將剩余的上清液吸入細(xì)胞裂解液預(yù)洗過的Protein A或Protein G Agarose中做預(yù)清除，以去除非特異結(jié)合的蛋白。在4℃搖床上反應(yīng)1 h，快速離心20～30 s，吸取上清，加入相應(yīng)的抗體及同源的對(duì)照抗體IgG，4℃搖床上反應(yīng)2 h;加入新的預(yù)處理過的Protein A或Protein G Agarose在4℃搖床上反應(yīng)1 h;快速離心，棄上清，用裂解液洗滌Protein A或Protein G Agarose。加入1×loading buffer 50～100μL，同時(shí)將 Input加入5×loading buffer，95°C煮10 min使蛋白變性;將上清液吸入新的EP管中，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1．2．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11．0統(tǒng)計(jì)軟件，選用方差分析或t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 C1QBP及 PKCζ在細(xì)胞中的表達(dá) C1QBP、PKCζ在 THP-1、RAW264．7、MDA-MB-231 三種細(xì)胞系中均有較高表達(dá)(圖1)。

圖1 C1QBP 及 PKCζ在 THP-1、RAW264．7、MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)

2．2 C1QBP表達(dá)對(duì)THP-1細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)的影響采用siRNA技術(shù)降低THP-1細(xì)胞中C1QBP蛋白的表達(dá)，篩選該蛋白表達(dá)量降低的有效序列為1和3(圖2)。顯示C1QBP表達(dá)下調(diào)可以明顯抑制THP-1細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)(P＜0．01)(圖3)。

2．3 C1QBP表達(dá)對(duì)THP-1細(xì)胞聚合能力的影響C1QBP表達(dá)降低導(dǎo)致CSF-1誘導(dǎo)的F-actin聚合能力降低(圖4)。

2．4 C1QBP與PKCζ的相互作用 經(jīng)CSF-1刺激THP-1細(xì)胞后提取總蛋白，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C1QBP與PKCζ可以相互作用(圖5)。

3 討論

圖2 C1QBP蛋白表達(dá)量降低的有效序列

圖3 C1QBP表達(dá)下降對(duì)THP-1趨化運(yùn)動(dòng)的影響

圖4 THP-1中C1QBP表達(dá)下降對(duì)CSF-1誘導(dǎo)的F-actin聚合能力的影響

圖5 C1QBP與PKCζ在THP-1中的相互作用

機(jī)體在病毒、細(xì)菌脂多糖等外源性或白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、干擾素等內(nèi)源性炎癥因子刺激下產(chǎn)生大量的趨化因子，趨化單核/巨噬細(xì)胞到達(dá)炎性部位并活化，因此單核/巨噬細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)在抵御病原體感染過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［3］。巨噬細(xì)胞入侵對(duì)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移起著重要的作用。在腫瘤形成之前常有大量的巨噬細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞在腫瘤原位聚集，慢性炎癥可加重病灶部位的巨噬細(xì)胞聚集，這些炎癥細(xì)胞可被反復(fù)激活并釋放活性氧，造成組織細(xì)胞損傷、轉(zhuǎn)化以致癌變［4］。腫瘤中表達(dá)的CSF-1能加快單核/巨噬細(xì)胞向腫瘤組織的趨化［5］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)抑制巨噬細(xì)胞向腫瘤聚集可以明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［4，6］。目前，細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)的調(diào)控機(jī)制尚待完善，闡明單核細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)的分子機(jī)制，對(duì)炎性疾病及腫瘤治療具有重要意義。細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)需要很多蛋白分子參與，它們分布于細(xì)胞的不同位置，發(fā)揮各自不同的作用。如果抑制某一個(gè)或幾個(gè)分子的活化過程，勢(shì)必會(huì)直接或間接影響細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)能力。C1QBP是一種多功能伴侶蛋白，其詳細(xì)的生理功能還不是很清楚。C1QBP與透明質(zhì)酸相互作用，促使細(xì)胞間黏附和去黏附的產(chǎn)生，并參與了染色體的組建［7］;與Clq結(jié)合調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖［8］;與 ASF/SF2結(jié)合，調(diào)節(jié)前mRNA的剪接［9］。最近的研究表明，線粒體中的p32還參與了ARF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及維持腫瘤細(xì)胞的氧化磷酸化［10，11］。本研究利用小RNA干擾技術(shù)降低 THP-1細(xì)胞 C1QBP的表達(dá)，首次發(fā)現(xiàn)C1QBP表達(dá)沉默可抑制THP-1細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)，降低F-actin聚合能力。因此我們認(rèn)為C1QBP在調(diào)節(jié)THP-1細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)中起重要作用。

PKCζ的12種亞型構(gòu)成了一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶超家族，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)及凋亡。此外，PKCζ還參與了細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞的極化、分化、運(yùn)動(dòng)和腫瘤轉(zhuǎn)移等［12］。研究發(fā)現(xiàn)，PKCζ在調(diào)節(jié)腫瘤及單核/巨噬細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)中起重要的作用;PKCζ通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的聚合參與了巨噬細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)，PKCζ降表達(dá)可以抑制CSF-1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)，同時(shí)也抑制MCP-1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)［13～15］。因此，PKCζ是G蛋白偶聯(lián)受體和酪氨酸激酶受體所誘導(dǎo)的信號(hào)通路中一個(gè)共用的信號(hào)分子，同時(shí)也是細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)途徑中的關(guān)鍵分子。

研究發(fā)現(xiàn)，活化的PKCζ與p32在體外結(jié)合明顯增強(qiáng)，p32可能在PKCζ轉(zhuǎn)位及功能的調(diào)節(jié)方面起重要作用［16］。近期有研究證實(shí)，p32參與調(diào)節(jié)PKCζ從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位后，p32、PKCζ和mL-gl2蛋白結(jié)合形成暫時(shí)的三元絡(luò)合物，PKCζ被激活，進(jìn)一步磷酸化 mLgl2蛋白，繼而調(diào)節(jié)細(xì)胞的極性［17］。在單核/巨噬細(xì)胞中，C1QBP與 PKCζ的相互作用尚無(wú)報(bào)道。本研究利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C1QBP與PKCζ之間存在相互作用。進(jìn)一步探討二者之間的相互作用機(jī)制，可能對(duì)揭示單核/巨噬細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)中的調(diào)節(jié)機(jī)制有重要意義。

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