膠體金/DNA體系法快速測定不同水質(zhì)中銀離子*

程曉宏，謝 超，史玉坤

醛類、酸類等消毒劑殺菌面廣，但毒性強(qiáng)、腐蝕性強(qiáng)。氯類消毒劑作用速度快，性質(zhì)穩(wěn)定，但其有效濃度低、易受酸、堿及其他物理、化學(xué)因素的影響，且消毒飲用水后的副產(chǎn)物有“三致”效應(yīng)[1]。銀離子消毒劑是一種新型無毒、無味、無刺激、無污染的“綠色殺菌制[1]。銀離子還廣泛應(yīng)用作抗菌藥物的敷料[2]。目前銀離子的檢測方法主要有重量分析法、比濁法[3]、原子吸收法[4]、電化學(xué)法[5]等。膠體金是氯金酸在還原劑作用下，聚合成一定納米尺度的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)：分散狀態(tài)的膠體金呈紅色；聚集狀態(tài)的膠體金呈藍(lán)色[6-7]。膠體金具有較大的比表面積，能吸附DNA，形成耐受一定濃度鹽的膠體金/DNA體系[8]。加入銀離子，由于銀離子與胞嘧啶C能選擇性地結(jié)合，形成C-Ag+-C復(fù)合物[9]，使得吸附在膠體金表面的DNA和膠體金分離。膠體金在沒有DNA大分子的保護(hù)下，遇鹽會被破壞而聚集變成藍(lán)色[8]?；诖嗽?，我們建立了簡單快速、準(zhǔn)確靈敏的膠體金/DNA體系檢測銀離子的方法。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）試劑：氯金酸（阿拉丁試劑上海有限公司）。檸檬酸鈉、醋酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。DNA［C20(C)20，C30(C)30，C40(C)40］均購于北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司。DNA用20 mmol/L pH 7.4磷酸緩沖液（PBS）溶解，90℃恒溫水浴加熱4 min后，用冰迅速冷卻后，4℃低溫保存。本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為純凈水。膠體金的合成參照Liu的文獻(xiàn)[6]：所有玻璃器皿均用王水浸泡處理，純凈水洗滌干凈。將1 mL 1%的氯金酸溶液加入100 mL水中，加熱至沸騰，劇烈攪拌下快速加入2.5 mL 1%檸檬酸鈉（均用0.22 μm孔徑濾膜過濾）。在沸騰情況下繼續(xù)攪拌30 min，離去熱源后再攪拌10 min,將金膠溶液置于棕色瓶中4℃低溫保存，3個月有效，平均粒徑為13 nm。（2）儀器：TU-1905紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器公司），AA240DUO原子吸收分光光度計（美國瓦里安公司），離心機(jī)TGL-16G（上海安亭科學(xué)儀器廠），恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）。

1.2 方法 取500 μL上述合成的膠體金與50 μL 10 μmol/L DNA渦旋均勻后，室溫孵育12 h，每分鐘14 000轉(zhuǎn)離心4 min，棄去上清液。加200 μL純凈水渦旋，再加入 400 μL 20 mmol/L pH 7.4 PBS 磷酸緩沖液，渦旋搖勻得膠體金/DNA體系。向體系中加入不同離子孵育，5 min后掃描400～800 nm光譜圖，通過比較加入離子前后A660/A530變化大小。

2 結(jié) 果

2.1 比較不同尺寸膠體金對吸光度信號變化的影響 膠體金/DNA體系參考Medley文獻(xiàn)[10]，太小尺寸和太大尺寸的膠體金，對信號變化貢獻(xiàn)較小，中等尺寸膠體金信號變化最大。我們采用較易合成的、中等尺寸的膠體金（13 nm）[6]用于分析。太短長度的DNA C20與膠體金自組裝效果不理想，且耐鹽效果較差。太長長度DNA C40易形成DNA分子間CAg+-C復(fù)合物，反而會增加膠體金間的距離，而使得信號變化較小。免標(biāo)記的C30被選擇用于自組裝成的膠體金/DNA體系，且該體系的構(gòu)建成本大大降低。

2.2 鹽對膠體的穩(wěn)定性有較大影響 較多的鹽（如80 mmol/L NaAc）讓膠體金/DNA體系不穩(wěn)定，溶液迅速變藍(lán)。較少的鹽（如20 mmol/L NaAc）而使得體系顏色變化不明顯。比較40mmol/L NaAc、50mmol/L NaAc、60 mmol/L NaAc不同濃度的鹽，對膠體金/DNA體系靈敏度的貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)50 mmol/L NaAc讓膠體金/DNA體系相對穩(wěn)定，故選擇用于體系分析，且加入靶分子后體系有較高靈敏度。室溫下比較加入銀離子前、后A660/A530變化情況，加入銀離子5 min后，A660/A530基本能達(dá)到穩(wěn)定。故選擇5 min作為體系的檢測時間。

2.3 膠體金/DNA體系對銀離子的響應(yīng)情況 對膠體金/DNA體系進(jìn)行光譜掃描，體系最大波長為530 nm（圖1）。當(dāng)向膠體金/DNA體系中逐漸滴加銀離子（0.1～2.0 μg/mL），膠體金/DNA 體系特征波長（530 nm）下的吸收下降較快，表明銀離子確實(shí)能和C堿基結(jié)合。膠體金在沒有DNA大分子的保護(hù)下，遇鹽會被破壞；膠體金/DNA體系會由分散狀態(tài)的紅色變成聚集狀態(tài)的藍(lán)色。

圖1 膠體金/DNA體系對銀離子的響應(yīng)

2.4 工作曲線、檢出限、精密度 參考文獻(xiàn)[6，8]，采用A660/A530大小來表示Ag+對膠體金/DNA體系的響應(yīng)情況（圖 2）。Ag+與 A660/A530 在 0.1～2.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，線性回歸方程為A660/A530=0.1074c+0.3982，相關(guān)系數(shù) r=0.999，式中 A660/A530為兩波長下吸光度的比值，c為銀離子濃度。用3倍空白偏差除以回歸方程斜率求得檢出限為0.05 μg/mL。平行 7 次測定 1.0 μg/mL Ag+，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.8%。

圖2 膠體金/DNA體系對銀離子的響應(yīng)情況

2.5 干擾試驗(yàn) 采用 1 μg/mL Ag+，100 μg/mL 對水中 Ca2+、Mg2+、Sr2+、Cu2+、Zn2+、Hg2+、Cd2+、Fe3+、Al3+、Co2+、Ni2+等常見的金屬離子進(jìn)行考察，均未發(fā)現(xiàn)明顯干擾。

2.6 樣品測定 分別準(zhǔn)確移取自來水、湖水、廢水1 L于大燒杯中，加入新鮮H2O21 mL煮沸約0.5 h，蒸餾后得250 mL自來水、湖水、廢水樣品。按照試驗(yàn)方法測定處理好的自來水、湖水、廢水水樣中Ag+的含量，結(jié)果見表1。本法與原子吸收光度法（AAS）測定結(jié)果基本吻合，并對樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，加標(biāo)回收率為95.0%～105.6%。經(jīng)典方法試驗(yàn)與回收率試驗(yàn)驗(yàn)證本法可靠，可應(yīng)用于水質(zhì)中銀離子的快速檢測。

表1 測定6次自來水、湖水、廢水中銀分析結(jié)果（μg/mL，%）

3 討 論

常用的測銀的方法有重量法、比濁法、原子吸收法、電化學(xué)法等。重量法、比濁法簡便適用性廣,是測銀最常用的常量分析方法。原子吸收法、電化學(xué)法靈敏度高，但需要較強(qiáng)的專業(yè)人員操作、復(fù)雜的電極制備、電位富集等操作步驟。膠體金/DNA體系檢測銀離子方法，是基于膠體金獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)和胞嘧啶C堿基與銀離子選擇性識別，而建立的簡單快速、準(zhǔn)確靈敏方法。究其本質(zhì)它是一種低成本、較高靈敏度的光度分析方法。免標(biāo)記DNA直接用于使得檢測成本降低，增加DNA鏈上C堿基數(shù)，或控制體系鹽的濃度來增加測定的靈敏度。目前銀離子的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法中，尚無膠體金/DNA體系法。作為成本低、靈敏度較高、準(zhǔn)確度較好的膠體金/DNA體系法對水質(zhì)中銀的測定，有一定的實(shí)際意義和參考價值。

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