前庭習(xí)服對(duì)運(yùn)動(dòng)病大鼠前庭核和海馬細(xì)胞c-Fos表達(dá)的影響*

張?jiān)品?，李 霞 ，姜正林 **

（1南通大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 226001；2南通大學(xué)航海醫(yī)學(xué)研究所）

運(yùn)動(dòng)病是指機(jī)體在受到異常運(yùn)動(dòng)刺激時(shí)，眼、前庭感受器和肌肉本體感受器等感覺傳入信息間失去平衡，或新的運(yùn)動(dòng)感覺與原有感覺經(jīng)驗(yàn)不一致，表現(xiàn)出惡心，嘔吐，異食癖等一系列胃腸道癥狀[1]。隨著航海航空航天事業(yè)的發(fā)展，有關(guān)運(yùn)動(dòng)病的研究越來越被人們重視。前庭習(xí)服是防治運(yùn)動(dòng)病的一項(xiàng)重要的干預(yù)手段[2-3]，它是指在運(yùn)動(dòng)環(huán)境中進(jìn)行適應(yīng)性鍛煉，繼而對(duì)某一特定運(yùn)動(dòng)刺激的耐受力提高的行為學(xué)表現(xiàn)。闡明機(jī)體對(duì)前庭刺激的適應(yīng)機(jī)制,不僅可以更好地理解運(yùn)動(dòng)病發(fā)生的病理生理機(jī)制，且還助于人類探尋更有效的防治運(yùn)動(dòng)病的新方法。但到目前為止，前庭習(xí)服的機(jī)制尚不清楚。早在1994年Wood等[2]曾指出習(xí)服就是中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)反復(fù)出現(xiàn)的同一種刺激方式慢慢形成的積極有效的反應(yīng)，其過程與條件反射相似，但它又是一種特殊的條件性喚醒和“學(xué)習(xí)行為”，但前庭習(xí)服行為過程中學(xué)習(xí)記憶的參與及其具體機(jī)制少有報(bào)道。

c-Fos基因是即早基因的一種，正常情況下表達(dá)很低，多種刺激可引起其在腦內(nèi)快速而短暫的表達(dá)增高，形成大量c-Fos蛋白。作為核內(nèi)反式作用因子，可將細(xì)胞外信息傳遞到核內(nèi)，通過與核蛋白Jun通過“亮氨酸拉鏈”形成Fos/Jun二聚體，即激活蛋白（activator protein-1,AP-1）[4-5]。AP-1 可特異地結(jié)合某些基因的特異位點(diǎn)TGACTA，誘導(dǎo)靶基因表達(dá)。將c-Fos的反義ODN注射到大鼠海馬，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物的長時(shí)程記憶（long term memory,LTM）降低40%以上，提示c-Fos在LTM中起重要作用[6]。研究還發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物的記憶過程中都伴有c-Fos的表達(dá)，提示c-Fos表達(dá)與記憶可能存在密切關(guān)系[7]。本研究采用免疫組化法對(duì)習(xí)服前后運(yùn)動(dòng)病敏感組大鼠，腦內(nèi)前庭核和海馬腦區(qū)c-Fos陽性神經(jīng)元在旋轉(zhuǎn)刺激后數(shù)量的統(tǒng)計(jì)分析，深入探討海馬神經(jīng)元在前庭習(xí)服中可能發(fā)揮的作用，為習(xí)服機(jī)制的基礎(chǔ)性研究提供細(xì)胞學(xué)線索。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）動(dòng)物：SD大鼠36只，雌雄各半，體重220～250g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。（2）試劑：兔抗c-Fos抗體（Santa Cruz公司）、生物素化的羊抗兔IgG（Sigma公司）、DAB顯色Kit（Vector公司）。

1.2 方法 （1）條件性厭食癥大鼠運(yùn)動(dòng)病模型制作：旋轉(zhuǎn)刺激裝置根據(jù)Crampton等的報(bào)道仿制而成[8]。實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠無束縛地放入旋轉(zhuǎn)裝置的有機(jī)玻璃籠內(nèi)，繞水平軸順時(shí)針旋轉(zhuǎn)。以16°/s2角加速度加速，達(dá)最高速度 120°/s2后，立即以 48°/s2的角減速度減速，直至旋轉(zhuǎn)停止為1個(gè)周期，歷時(shí)10s，如此反復(fù)刺激30min。觀察旋轉(zhuǎn)刺激后動(dòng)物對(duì)0.15%糖精水飲用量的減少情況，判定大鼠的運(yùn)動(dòng)病耐受力。(2)前庭習(xí)服模型制作：將運(yùn)動(dòng)病模型大鼠每隔1日給予上述旋轉(zhuǎn)刺激，每次30min，如此持續(xù)鍛煉28d，用旋轉(zhuǎn)刺激誘導(dǎo)條件性味覺厭惡的方法，判定這種鍛煉提高大鼠的運(yùn)動(dòng)病耐力的程度，來表明動(dòng)物是否獲得前庭功能習(xí)服。(3)免疫組織化學(xué)法：觀察正常組、習(xí)服前刺激組、習(xí)服后刺激組大鼠腦內(nèi)前庭核和海馬腦區(qū)c-Fos陽性神經(jīng)元的情況并進(jìn)行比較。每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受相應(yīng)刺激后立即按0.2mL/100g的標(biāo)準(zhǔn)，以復(fù)合麻醉劑腹腔麻醉，經(jīng)左心室向升主動(dòng)脈快速灌注生理鹽水150mL，然后用4%PFA灌注。切片采用冰凍切片機(jī)（Leica CM 1950,Germany），片厚10μm。免疫組化染色：一抗(按 1∶250 稀釋)，于 4℃冰箱中孵育過夜；HRP標(biāo)記的二抗 (按1∶1 000稀釋)，室溫下2h；后傾去液體，用0.01M PBS洗3次每次10min，再用DAB顯色Kit進(jìn)行顯色，中性樹脂封片后備用。圖像采集使用Olympus光學(xué)顯微鏡，并對(duì)相關(guān)腦區(qū)c-Fos陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，圖像分析使用軟件 ImageJ（美國 NIH）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Sigmaplot 12.0數(shù)據(jù)分析軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。用 Sigmastat 2.0 進(jìn)行 t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 習(xí)服鍛煉對(duì)旋轉(zhuǎn)刺激后大鼠糖精水飲用量影響 根據(jù)旋轉(zhuǎn)刺激后糖精水飲用量減少的幅度對(duì)36只大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)病敏感性評(píng)價(jià)。具體如下：先不予旋轉(zhuǎn)刺激，挑選出連續(xù)3天0.15%糖精水飲用量變化不大的大鼠，29只大鼠（90.6%）符合要求。旋轉(zhuǎn)刺激后發(fā)現(xiàn)14只大鼠糖精水飲用量較旋轉(zhuǎn)前顯著性減少，幅度達(dá)到20%以上。將這部分大鼠劃為運(yùn)動(dòng)病敏感組，其中6只作為旋轉(zhuǎn)刺激組，另外8只接受前庭習(xí)服訓(xùn)練。并分別于 0d、7d、14d、21d、28d 旋轉(zhuǎn)鍛煉后進(jìn)行糖精水飲用量的測量。通過比較鍛煉不同時(shí)間后，大鼠糖精水飲用量旋轉(zhuǎn)前后的減少百分比，對(duì)大鼠的前庭習(xí)服進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)。理論上該數(shù)值越接近0，習(xí)服效果越好。我們發(fā)現(xiàn)8只大鼠接受14次鍛煉后，有7只大鼠在鍛煉第28天的糖精水飲用量旋轉(zhuǎn)前后差異降低顯著。其中1只大鼠經(jīng)過28d旋轉(zhuǎn)鍛煉后，旋轉(zhuǎn)前后糖精水飲用量的減少百分比由31.6%下降至16.7%，呈降低趨勢，但并未降至10%以下或者習(xí)服前后減少的百分比未超過20%，剔除習(xí)服效果不佳者。對(duì)習(xí)服效果好的7只大鼠，飲用0.15%糖精水旋轉(zhuǎn)后減少百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。在訓(xùn)練7d、14d和21d后，旋轉(zhuǎn)后大鼠糖精水飲用量減少幅度與鍛煉前（0d）比較，由30.8%分別下降至19.71%、16.46%和 11.96%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖 1）。訓(xùn)練到 28d 時(shí)，大鼠對(duì)運(yùn)動(dòng)病完全習(xí)服，旋轉(zhuǎn)后大鼠糖精水飲用量減少幅度與鍛煉前（0d）比較，顯著性下降至 1.84%（P＜0.01），基本上回到基礎(chǔ)水平（圖1）。由此可見，前庭鍛煉可大大提高大鼠對(duì)運(yùn)動(dòng)病的耐受力，實(shí)現(xiàn)前庭習(xí)服，模型成功。

圖1 前庭習(xí)服鍛煉對(duì)旋轉(zhuǎn)刺激后大鼠0.15%糖精水飲用量的影響

2.2 習(xí)服鍛煉對(duì)前庭核和海馬腦區(qū)c-Fos陽性神經(jīng)元表達(dá)的影響 通過比較基礎(chǔ)狀態(tài)（未受旋轉(zhuǎn)刺激），對(duì)照組和全習(xí)服組在接受鍛煉前后旋轉(zhuǎn)刺激對(duì)前庭核團(tuán)c-Fos免疫標(biāo)記陽性神經(jīng)元數(shù)量的變化（表1和圖2），我們發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)病敏感組大鼠未經(jīng)習(xí)服鍛煉前，與基礎(chǔ)狀態(tài)組（n=3）相比，旋轉(zhuǎn)刺激組（n=3）大鼠前庭核團(tuán)c-Fos陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加（P＜0.01）,但是當(dāng)大鼠經(jīng)過了長達(dá)28d為期14次的習(xí)服鍛煉后，對(duì)7只全習(xí)服大鼠前庭核團(tuán)c-Fos陽性神經(jīng)元數(shù)目的觀察結(jié)果顯示免疫陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，與基礎(chǔ)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與前庭核團(tuán)不同（表 1），在未習(xí)服鍛煉前，海馬腦區(qū)c-Fos陽性神經(jīng)元數(shù)量在旋轉(zhuǎn)刺激后較刺激前有增高的趨勢（P＞0.05）,隨著習(xí)服訓(xùn)練的完成，全習(xí)服化的7只大鼠海馬腦區(qū)c-Fos陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯增多差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 習(xí)服鍛煉前后前庭核團(tuán)與海馬腦區(qū)c-Fos免疫陽性反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量受旋轉(zhuǎn)刺激影響

圖2 習(xí)服鍛煉前后前庭核團(tuán)與海馬腦區(qū)c-Fos免疫陽性反應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞變化

3 討 論

前庭習(xí)服作為防治運(yùn)動(dòng)病的重要手段其形式繁多，可經(jīng)常乘坐交通工具以獲得一定的適應(yīng)。也可進(jìn)行蕩秋千、滾輪、過山車和某些特殊體育運(yùn)動(dòng)，來鍛煉前庭功能以獲得適應(yīng)[3]。雖然其具體效果會(huì)受到運(yùn)動(dòng)刺激的頻率、持續(xù)時(shí)間及強(qiáng)度和類型的影響，但因其無副作用且長期療效穩(wěn)固，在航空、航天與航海領(lǐng)域備受關(guān)注。

習(xí)服具體有兩種形式，一種是快速耐受，即通過持續(xù)地暴露于同一運(yùn)動(dòng)刺激條件下，經(jīng)3～4d形成對(duì)該運(yùn)動(dòng)刺激的習(xí)服。另一種是階段性耐受即適應(yīng)性前庭功能鍛煉，通過對(duì)某一運(yùn)動(dòng)刺激方式間斷地反復(fù)地暴露而產(chǎn)生適應(yīng)。它可有效地降低機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)病的敏感性，對(duì)運(yùn)動(dòng)病的發(fā)生起到很好的預(yù)防作用。這一過程其實(shí)是對(duì)某種學(xué)習(xí)內(nèi)容的喚醒，其發(fā)生很可能與腦內(nèi)某些特定中樞受前庭刺激后代償性的激活有關(guān)[2]。作為信息傳遞的“第三信使”，c-Fos在神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)傳遞中通過促使應(yīng)激刺激后機(jī)體內(nèi)某些特定基因表達(dá)改變，使得短時(shí)程信號(hào)發(fā)揮長時(shí)程效應(yīng)，繼而激發(fā)了腦內(nèi)相應(yīng)核團(tuán)神經(jīng)元產(chǎn)生可塑性改變[9-11]。本研究顯示海馬作為參與學(xué)習(xí)記憶環(huán)路的重要腦區(qū)，在通過隔天的反復(fù)適應(yīng)性前庭功能鍛煉后，大鼠對(duì)前庭刺激完全耐受。此時(shí)c-Fos在海馬腦區(qū)的表達(dá)明顯增高，提示海馬腦區(qū)在習(xí)服后發(fā)生激活，參與到前庭習(xí)服形成的神經(jīng)可塑性環(huán)路中。同時(shí)前庭核團(tuán)本身在習(xí)服后，c-Fos標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)量的降低也說明，前庭核團(tuán)的神經(jīng)元活動(dòng)在大鼠對(duì)前庭刺激耐受的情況下，發(fā)生了可塑性改變。這些均支持前庭習(xí)服與學(xué)習(xí)記憶，及海馬神經(jīng)元突觸可塑性間存在密切聯(lián)系的觀點(diǎn)。乙酰膽堿是與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，Takeda[12]認(rèn)為與運(yùn)動(dòng)病發(fā)生密切相關(guān)的中樞乙酰膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，可能參與前庭習(xí)服的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)抗膽堿能藥物東莨菪膽堿，一方面可通過調(diào)節(jié)Ach的含量，以減弱腦內(nèi)中樞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)不平衡的現(xiàn)象，從而達(dá)到預(yù)防運(yùn)動(dòng)病的發(fā)生。另一方面還可通過易化或敏化前庭適應(yīng)或前庭習(xí)服的過程來發(fā)揮作用，這在去甲腎上腺素能和組胺能中樞遞質(zhì)系統(tǒng)與運(yùn)動(dòng)病關(guān)系的研究中尚無報(bào)道。那么，這是否提示乙酰膽堿或M型膽堿受體可能是受c-Fos激活后AP-1調(diào)節(jié)的下游靶基因影響，繼而參與前庭習(xí)服過程的敏化，具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究從c-Fos蛋白入手，將神經(jīng)環(huán)路可塑性與前庭習(xí)服的機(jī)制聯(lián)系起來，為進(jìn)一步探討運(yùn)動(dòng)病前庭習(xí)服的調(diào)控機(jī)制及生理意義奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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