霉酚酸酯對(duì)IgA腎病大鼠腎組織中TGF－β1及Smad2/3表達(dá)的影響

高嫻緋，趙凱姝，翟淑波，馬青山

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院，長(zhǎng)春130021)

IgA腎病(IgAN)是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球疾病，以腎小球系膜區(qū)有大量顆粒性IgA或以IgA為主的循環(huán)免疫復(fù)合物沉積為特征，其發(fā)病機(jī)制目前不清。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、Smad蛋白已被證實(shí)為IgAN病理機(jī)制中的關(guān)鍵性因子［1］。大量臨床研究證實(shí)，免疫抑制劑霉酚酸酯(MMF)聯(lián)合激素治療IgAN有較好的臨床效果［2］。本研究觀察了MMF對(duì)IgAN大鼠腎組織中TGF-β1及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad2/3表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步探討MMF治療IgAN的效果及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6周齡健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量(180±20)g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按照SPF級(jí)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1．1．2 主要試劑與藥物 牛血清白蛋白(Bevine Serum albumin，BSA)購(gòu)自上海生物工程有限公司;脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;異硫氰酸熒光素標(biāo)記兔抗大鼠IgA抗體、TGF-β1抗體、Smad2/3抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;MMF購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 動(dòng)物分組及處理 將24只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、MMF組、模型組各8只。后兩組均參考文獻(xiàn)［3］建立IgAN模型:自實(shí)驗(yàn)第1天起以BSA 400 mg/kg(蒸餾水配成水溶液4 mL/kg)隔日灌胃1次，共8周;皮下注射蓖麻油 0．3 mL+CCl40．1 mL，每周 1次，持續(xù)9周;第6周自尾靜脈注射LPS 0．05 mg/只(用0．9%NaCl配成溶液0．5 mL)。自第9周開(kāi)始，MMF組予MMF 10 mg/(kg·d)每日灌胃1次，對(duì)照組和模型組予等量蒸餾水灌胃，持續(xù)至12周末。

1．2．2 尿液指標(biāo)檢測(cè) 分別于第 4、6、8、10、12 周末將各組大鼠放入代謝籠，收集24 h尿液，4 000 r/min離心10 min后取上清，用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)24 h尿蛋白定量;取尿沉渣用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)紅細(xì)胞。

1．2．3 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 各組均于第12周末以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后自腹主動(dòng)脈取全血，以3 000 r/min離心10 min分離血清。用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血 BUN、SCr、ALT、AST、總蛋白(TP)、Alb、TG、CH。

1．2．4 腎組織病理學(xué)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取各組大鼠腎組織標(biāo)本，經(jīng)固定、脫水、透明、石蠟包埋，切片3μm厚。HE染色觀察腎組織病理學(xué)改變。用直接法進(jìn)行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察有無(wú)IgA沉積，電鏡下觀察腎組織病理超微結(jié)構(gòu)改變。

1．2．5 腎組織 TGF-β1、Smad2/3表達(dá)的檢測(cè) 用SP免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TGF-β1、Smad2/3定位和表達(dá)。取各組大鼠腎組織標(biāo)本，經(jīng)固定、脫水、透明、石蠟、包埋，切片3μm厚，80℃烘烤3 h;經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化;蒸餾水洗1 min，PBS沖洗3次;滴加3%過(guò)氧化氫溶液室溫放置10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;PBS洗3次;滴加正常山羊免疫血清封閉液，室溫放置15 min，傾去血清，勿洗，滴加按1∶100稀釋的Smad2、Smad3特異性一抗，4℃冰箱過(guò)夜;PBS沖洗3次;滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫10 min;PBS洗5 min×3次;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫10 min;PBS洗5 min×3次;DAB顯色，顯微鏡下作用1～2 min，至顯色滿意，蒸餾水終止顯色。蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，流水沖洗返藍(lán)1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。細(xì)胞質(zhì)染呈棕黃色，細(xì)胞核由蘇木素復(fù)染為藍(lán)色為陽(yáng)性表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)。所得數(shù)據(jù)采用Motic Images Advanced 3．2圖像分析儀獲取灰度值。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，資料正態(tài)分布且方差齊時(shí)，多組比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法;資料偏態(tài)分布或方差不齊時(shí)，多組比較采用秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis法)，組間兩兩比較用Nemenyi法。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 尿液指標(biāo)

2．1．1 尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù) 0至第4周末，三組尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)相比差異無(wú)顯著性(P＞0．05);第6～8周末，模型組與MMF組尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯升高，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0．05);第10～12周末，MMF組尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)較模型組明顯減少，差異有顯著性(P ＜0．05)，詳見(jiàn)表1。

2．1．2 24 h尿蛋白定量 0至第6周末，三組24 h尿蛋白定量相比差異無(wú)顯著性(P＞0．05);第6～8周末，模型組與MMF組24 h尿蛋白定量明顯升高，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0．05);第10～12周末，MMF組24 h尿蛋白定量較模型組明顯減少，差異有顯著性(P＜0．05)，詳見(jiàn)表2。

表1 三組尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(個(gè)/μL±s)

表1 三組尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(個(gè)/μL±s)

注:與對(duì)照組相比，*P ＜0．05;與模型組相比，△P ＜0．05

時(shí)間 n尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)0周 4周 6周 8周 10周 12周模型組 8 28．00 ±10．06 51．67 ±24．94 181．50 ±51．38* 245．83 ±42．67* 256．83 ±35．53* 245．67 ±48．64*MMF 組 8 34．67 ±19．96 44．33 ±16．40 169．33 ±46．58* 227．00 ±33．13* 184．67 ±35．00＊△ 138．33 ±35．88＊△對(duì)照組 8 27．83 ± 6．49 32．33 ±14．45 38．83 ±16．04 42．33 ±21．89 40．83 ±20．32 35．33 ±14．47

2．2 血生化指標(biāo) 模型組與MMF組血清BUN、

表2 三組24 h尿蛋白定量比較(mg/24 h±s)

表2 三組24 h尿蛋白定量比較(mg/24 h±s)

注:與對(duì)照組相比，*P ＜0．05;與模型組相比，△P ＜0．05

時(shí)間 n尿蛋白0周 4周 6周 8周 10周 12周模型組 8 3．93 ±1．549 5．34 ±0．739 5．09 ±1．250 12．18 ±3．311* 11．85 ±2．030* 11．06 ±1．641*MMF 組 8 4．35 ±1．079 4．61 ±1．209 5．10 ±2．119 11．00 ±2．521* 9．26 ±1．915＊△ 8．71 ±1．699＊△對(duì)照組 8 4．61 ±1．293 4．28 ±1．065 4．18 ±1．058 4．09 ±1．074 3．95 ±0．933 4．65 ±0．824

SCr、ALT、AST、TP、ALB、TG、CH 與對(duì)照組相比，差 異無(wú)顯著性(P ＞0．05)，詳見(jiàn)表3。

表3 三組血生化指標(biāo)比較±s)

表3 三組血生化指標(biāo)比較±s)

組別 n BUN(mmol/L)SCr(μmol/L) ALT(U/L) AST(U/L) TP(g/L) ALB(g/L) TG(mmol/L)CH(mmol/L)MMF 組 8 7．20 ±0．77 28．95 ±3．12 48．17 ± 8．29 143．67 ±35．57 54．95 ±12．95 32．97 ±2．31 1．33 ±0．23 1．33 ±0．17模型組 8 7．77 ±0．33 29．30 ±2．18 51．67 ± 8．55 138．50 ±23．93 50．05 ±13．58 32．05 ±0．93 1．38 ±0．23 1．42 ±0．18對(duì)照組 8 6．90 ±1．02 26．82 ±4．19 46．50 ±10．51 146．00 ±21．56 62．83 ±14．65 35．00 ±2．10 1．17 ±0．26 1．29 ±0．17

2．3 腎組織病理學(xué)改變 光鏡下，對(duì)照組腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)無(wú)增生，毛細(xì)血管襻開(kāi)放，腎小球、腎小管、間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常;模型組腎小球系膜細(xì)胞增生，系膜基質(zhì)增多，毛細(xì)血管管腔狹窄，腎小管間質(zhì)有較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞腫脹變性;MMF組病理改變較模型組有所減輕，腎小球系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)輕度增生，毛細(xì)血管管腔輕度狹窄，腎小管上皮細(xì)胞輕度變性，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。電鏡下，對(duì)照組腎小球足細(xì)胞足突正常，基底膜完整、均勻一致，系膜區(qū)系膜細(xì)胞無(wú)增生，腎小管上皮細(xì)胞正常;模型組系膜區(qū)基質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較多電子致密物，腎小囊內(nèi)微絨毛化，毛細(xì)血管腔變大;MMF組系膜區(qū)改變較模型組減輕，腎小管上皮細(xì)胞未見(jiàn)壞死，毛細(xì)血管襻開(kāi)放好。熒光顯微鏡下，對(duì)照組腎小球系膜區(qū)無(wú)IgA沉積;模型組腎小球系膜區(qū)有黃綠色強(qiáng)IgA熒光;MMF組腎小球系膜區(qū)內(nèi)IgA黃綠色熒光強(qiáng)度較模型組減弱。

2．4 腎組織中TGF-β1及 Smad2、Smad3的表達(dá)與分布 對(duì)照組大鼠腎組織中有少量 TGF-β1及Smad2、Smad3 表 達(dá);模 型組 TGF-β1 及 Smad2、Smad3陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng);MMF組 TGF-β1及 Smad2、Smad3表達(dá)較模型組減弱，其灰度值詳見(jiàn)表4。

表4 三組腎組織中TGF-β1、Smad2、Smad3灰度值比較(n=8±s)

表4 三組腎組織中TGF-β1、Smad2、Smad3灰度值比較(n=8±s)

注:與對(duì)照組相比，*P ＜0．05;與模型組相比，△P ＜0．05

組別 TGF-β1 Smad2 Smad3 MMF 組 125．40 ±2．95＊△ 135．37 ±2．26＊△ 133．07 ± 7．63＊△模型組 72．98 ±2．08* 80．80 ±5．97* 97．67 ±15．13*對(duì)照組199．98 ±5．80 193．48 ±6．16 219．77 ±11．41

3 討論

研究顯示，IgAN的預(yù)后差異較大，部分患者以進(jìn)行性腎臟損傷為顯著特征。近年來(lái)研究表明，在確診IgAN的20 a內(nèi)有15%～40%的患者進(jìn)入終末期腎病(End-stage renal disease，ESRD)［4］，由于腎小管纖維化被視為導(dǎo)致終末性腎臟衰竭的最終途徑［5］，采取有效措施控制腎纖維化的發(fā)展成為控制該病進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

研究證實(shí)，TGF-β1既是導(dǎo)致IgAN的中間因子，亦是加重腎臟損傷和纖維化的關(guān)鍵因素，其高表達(dá)于IgAN患者和系膜增生型腎小球硬化模型中［1，6，7］，且在系膜增生型腎小球硬化模型的實(shí)驗(yàn)研究中，TGF-β1拮抗劑可減輕IgAN患者的腎小球硬化［8］。與普通人群相比，有高表達(dá) TGF-β1基因的患者，TGF-β1蛋白表達(dá)越高，其腎臟損傷也愈重［9］。對(duì)處于IgAN早期炎癥改變階段的患者，TGF-β1蛋白是導(dǎo)致細(xì)胞增生和分泌的細(xì)胞因子［10］。因此，TGF-β1被視為反映IgAN預(yù)后及治療效果的關(guān)鍵指標(biāo)［11］。Smad蛋白是使 TGF-β1目的基因表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，根據(jù)作用不同可分為三類［12］:受體激活型如 Smad1、Smad2、Smad3，共同介質(zhì)型如Smad4，抑制型如Smad6、Smad7等。TGF-β1與胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合后，能引起受體激活型Smad2/3蛋白磷酸化，進(jìn)而吸引共同介質(zhì)型Smad4形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，加速纖維化進(jìn)展［13］。大量研究表明，在IgAN患者及IgAN動(dòng)物模型中 TGF-β1、Smad2/3 的表達(dá)升高［14～17］。近年來(lái)的大量藥物研究發(fā)現(xiàn)，多種對(duì)于IgAN療效顯著的藥物，可通過(guò)降低Smad2/3及 TGF-β1表達(dá)延緩 IgAN大鼠腎臟病變惡化的持續(xù)進(jìn)展［15，16］。上述研究表明，Smad蛋白增多可導(dǎo)致 TGF-β1表達(dá)升高，進(jìn)而加重IgAN病變進(jìn)展。因此，可通過(guò)降低Smad蛋白水平下調(diào)TGF-β1表達(dá)，從而減輕IgAN病變程度。

MMF聯(lián)合激素治療IgAN療效肯定，能顯著降低尿蛋白水平、保護(hù)腎功能，且毒副作用相對(duì)較少、患者耐受性好［2］。在MMF緩解單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型［18］、糖尿病大鼠模型等腎臟損傷病理機(jī)制的研究中，學(xué)者認(rèn)為機(jī)制可能為通過(guò)減少Smad2/3蛋白、下調(diào)TGF-β1的過(guò)度表達(dá)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。本研究中，第6～8周末模型組及MMF組24 h尿蛋白定量、尿液紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著高于對(duì)照組，腎臟病理改變均重于對(duì)照組;模型組較對(duì)照組腎組織中TGF-β1及Smad2/3表達(dá)升高。提示前兩組成功建立IgAN模型，根據(jù)其腎臟病理表現(xiàn)及造模時(shí)長(zhǎng)判定為早期輕微病變型;TGF-β1及Smad2/3為IgAN病理機(jī)制中的關(guān)鍵性因子，輕微病變?cè)缙跁r(shí)兩者表達(dá)即升高，且腎臟病理改變?cè)街?，表達(dá)水平升高越明顯。故TGF-β1及Smad2/3可能成為反映IgAN腎臟病變嚴(yán)重程度的敏感指標(biāo)。本研究還顯示，第10～12周末MMF組24 h尿蛋白定量、尿液紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著低于模型組，腎臟病理改變輕于模型組，TGF-β1、Smad2/3表達(dá)低于模型組。提示 MMF治療IgAN有效，機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)Smad2/3表達(dá)，而減少TGF-β1的過(guò)量表達(dá)、延緩IgAN的進(jìn)展。有關(guān)MMF對(duì)IgAN治療的確切機(jī)制及療效還需要進(jìn)一步深入研究和大量的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)來(lái)證實(shí)。

綜上所述，MMF治療IgAN的病理機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)Smad2/3、TGF-β1表達(dá)發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

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