綠盲蝽在人工飼料模型上刺吸波形EPG解析

周延樂，趙秋劍，張永軍，郭予元

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植物保護(hù)研究所/植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

隨著轉(zhuǎn)Bt 基因棉花在我國的大面積種植，棉鈴蟲等靶標(biāo)害蟲得到了有效的控制，但廣譜型農(nóng)藥使用量逐漸下降，使得棉田盲蝽發(fā)生數(shù)量劇增、為害加重，成為我國轉(zhuǎn)基因棉田的主要害蟲(Wu et al.，2002;郭建英等，2005;Wu and Guo，2005;Lu et al.，2010)。

刺吸波技術(shù)(Electrical Penetration Graph，EPG)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展成熟的一種研究植食性刺吸式昆蟲在寄主植物上刺探、取食行為的一種技術(shù)手段(蔡曉明，2008)。EPG 技術(shù)能夠長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)監(jiān)測(cè)刺吸式口器昆蟲的刺探行為，可以用來判斷目標(biāo)昆蟲對(duì)寄主的喜好程度，為鑒定寄主植物抗蟲性等提供依據(jù)。EPG 技術(shù)與視頻技術(shù)聯(lián)用，明顯地提高了分析效率(羅晨等，2005)。該技術(shù)提供了一種精確直觀研究刺吸式昆蟲取食行為的方式，能定量研究昆蟲在植物組織內(nèi)部分泌唾液和刺吸汁液等取食行為。2002年Cline和Backus 首次利用AC－EPG和錄像設(shè)備研究了美洲牧草盲蝽Lygus hesperus Knight 在人工飼料上的取食行為，成功記錄了7種取食波形和20 多種非取食波形，其刺探波大致可分為A、B、C1、C2、F波等幾類。短暫的A 波表示口針的刺入;不規(guī)則的B 波表示口針在撕裂寄主植物的組織和向外分泌唾液;規(guī)則的C1、C2波表示取食(Cline and Backus，2002)。目前采用EPG 開展的研究范圍已經(jīng)擴(kuò)展到寄主植物的選擇性、昆蟲傳毒機(jī)制和植物抗蟲機(jī)制以及內(nèi)吸性農(nóng)藥的測(cè)定等行為生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，研究的對(duì)象也由最初的蚜蟲擴(kuò)展到粉虱、葉蟬、薊馬、盲蝽等大多數(shù)刺吸式昆蟲(岳梅等，2005)。本文采用EPG 技術(shù)結(jié)合視頻觀察解析了綠盲蝽在人工飼料模型上的刺吸取食行為與對(duì)應(yīng)EPG 波形關(guān)系，以期為明確綠盲蝽 Apolygus lucorum(Meyer－Dür)寄主取食行為機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

綠盲蝽采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊科研中試基地棉田，室內(nèi)采用新鮮四季豆飼養(yǎng)5代，未施用任何殺蟲劑。室內(nèi)飼養(yǎng)條件為溫度28℃，相對(duì)濕度為60%，光照周期為16∶8(L∶D)。選取當(dāng)日蛻皮的4齡若蟲為測(cè)試?yán)ハx，測(cè)定前饑餓6 h。

1.2 人工飼料模型

在一個(gè)長(zhǎng)×寬×厚為6 cm×6 cm×0.6 cm的樹脂玻璃上設(shè)計(jì)一個(gè)直徑為4 cm，厚度為0.5 cm 的圓槽。圓槽中間放入4mL 含5%蔗糖的新鮮四季豆汁溶液作為人工食料，四季豆汁溶液由20 g 新鮮的四季豆和200mL 蒸餾水放入多功能攪拌機(jī)中攪碎取上清制成。連接導(dǎo)電銅絲后用拉伸的Parafilm 封口(圖1)。

圖1 a:飼料模型正面;b:飼料模型側(cè)面(仿Joost et al.，2006)Fig.1 a:Frontal view of artificial diet model;b:Side view of artificial diet model

1.3 刺吸電位波形記錄及行為觀察

刺吸電位電位儀Giga－8 DC－EPG 購自荷蘭。昆蟲電極為細(xì)銅絲，銅絲的頂端用導(dǎo)電膠連接長(zhǎng)約3 cm，直徑20 μm 的金絲。采用CO2麻醉饑餓后的綠盲蝽4齡若蟲使其背部朝上，把昆蟲電極的金絲一端蘸取適量導(dǎo)電膠，迅速粘結(jié)于綠盲蝽的前胸背板末端。將粘結(jié)于EPG 電極金絲之上的綠盲蝽轉(zhuǎn)移移至人工飼料模型Parafilm 表面，并保持一定的活動(dòng)范圍，將模型置于體視顯微鏡的目鏡視野內(nèi)。體視顯微鏡目鏡端連接攝像機(jī)并通過USB 線將數(shù)據(jù)傳輸至電腦。刺吸電位波形數(shù)據(jù)自動(dòng)采集并存儲(chǔ)，采用ANA 34 軟件進(jìn)行波形分析以及數(shù)據(jù)整理。通過體視顯微鏡，結(jié)合電腦視頻軟件，使觀察到的圖像與EPG 所對(duì)應(yīng)的波形同步，并進(jìn)行連續(xù)觀察。每頭綠盲蝽只測(cè)試1次，每次采集6 h，每種波形成功記錄50次(圖2)。

圖2 綠盲蝽在人工飼料模型上的EPG 記錄及行為觀察裝置(仿Joost et al.，2006)Fig.2 Equipment configuration for split screen video of A.lucorum sucking behavior and EPG waveforms

2 結(jié)果與分析

依據(jù)體視顯微鏡觀察到綠盲蝽實(shí)時(shí)取食行為(圖3)及對(duì)應(yīng)的刺吸波形，綠盲蝽在人工飼料模型上的EPG 波形可分為4種:口針刺入(圖4a)，即綠盲蝽口針刺破Parafilm 進(jìn)入人工飼料溶液的過程中，波形突然下降，中間有短暫的變化后維持在一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài)，刺入過程持續(xù)時(shí)間較短(0.1～0.2 s);口針攪動(dòng)(圖4b)，即綠盲蝽口針在人工飼料內(nèi)攪動(dòng)的過程(4～5 s)，波形出現(xiàn)高頻率劇烈變化，伴隨著攪動(dòng)過程，波形變化明顯;綠盲蝽口針在人工飼料內(nèi)上下抽動(dòng)(圖4c)，此階段持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)(19～35 s)，波形也出現(xiàn)劇烈變化，但變化的過程有一定的間隔;口針拔出(圖4d)，在綠盲蝽口針拔出過程中波形有一個(gè)先下降的趨勢(shì)，然后在恢復(fù)到刺探前水平，撥出過程很快(0.1～0.2 s)。另外，試驗(yàn)中未觀察到非刺探波形。

3 結(jié)論與討論

長(zhǎng)期以來，盲蝽一直屬于棉花上的次要害蟲，因而對(duì)于它的研究相對(duì)較少。相對(duì)薄弱的生物學(xué)研究基礎(chǔ)不能滿足日益嚴(yán)峻的盲蝽防控和綜合治理的需求。近幾年，盲蝽危害導(dǎo)致的棉花產(chǎn)量損失常達(dá)20%～30%，嚴(yán)重地區(qū)則高達(dá)50%。棉田盲蝽的種群爆發(fā)還波及了棗、葡萄、蘋果、桃、櫻桃、梨、茶樹等多種作物(陸宴輝和吳孔明，2008)。盲蝽的防治已經(jīng)成為影響我國多種農(nóng)作物生產(chǎn)的重要制約因子。對(duì)于盲蝽取食習(xí)性和行為的研究，可以為盲蝽的綜合治理提供一定的理論基礎(chǔ)。

通過實(shí)時(shí)記錄和觀察綠盲蝽在人工飼料模型上的EPG 波形及對(duì)應(yīng)刺吸行為，初步歸納獲得了綠盲蝽在食物模型上EPG 波形的生物學(xué)意義。趙秋劍等(2011)采用Giga－8 DC－EPG 采集綠盲蝽在14個(gè)棉花品種(系)上的取食行為，發(fā)現(xiàn)其EPG 波形分為5種:A 波為刺探波，H 波為口針在組織內(nèi)刺探，M 波為口針在組織內(nèi)破碎細(xì)胞并分泌唾液波，B 波為吸取混合物以及口針停留后拔出，NP 波為喙和口針停留在葉片表面并未刺入。本文發(fā)現(xiàn)綠盲蝽在食物模型上有4個(gè)取食波形，分別為口針刺入、口針攪動(dòng)、口針上下抽動(dòng)、口針拔出行為對(duì)應(yīng)的波形。這與趙秋劍等報(bào)道基本吻合，但未觀察到非刺探波形。由于昆蟲的取食和多種因素有關(guān)，雖然昆蟲的視覺和嗅覺對(duì)選擇寄主植物有一定的影響，但昆蟲落到植物上后，口針?biāo)綔y(cè)到的各種信息，包括葉表和葉組織內(nèi)部的物理、化學(xué)信息，對(duì)最終決定是否取食該植物具有重要的作用。從葉表到韌皮部，昆蟲的感受器可以探測(cè)到各種不同的化學(xué)信息，導(dǎo)致不同的取食反應(yīng)。如葉表的糖和生物堿，葉肉的多糖和pH 梯度以及韌皮部的氨基酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物、次生物質(zhì)還有葉肉的結(jié)構(gòu)對(duì)昆蟲接受寄主均有重要作用(Lei and Xu，1995)。人工飼料模型由于沒有外部蠟質(zhì)層、茸毛等物理因素，綠盲蝽的口針可能不需要在Parafilm 表面進(jìn)行刺吸取食前停留。相比之下，人工飼料模型內(nèi)部也沒有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，獲得EPG 波形相對(duì)較少，但在一定程度上可以揭示昆蟲的取食行為(Joost et al.，2006)。波形與昆蟲刺探、取食行為之間對(duì)應(yīng)關(guān)系的深入研究，必須借助一定的研究方法，如組織學(xué)技術(shù)、蜜露化學(xué)成分分析、生物染色液處理植物根系、觀察植物表面殘留口針中有無汁液溢出、直接觀察人工食物中口針的行蹤及直接觀察昆蟲口針在植物組織中的行蹤和利用放射性同位素技術(shù)等(陳建明等，2002)。EPG 研究與電鏡及視頻技術(shù)的結(jié)合，為明確口針的刺探部位與波形的對(duì)應(yīng)關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。Kimmins和Tjallingii(1985)在對(duì)甘藍(lán)蚜Brevicoryne brassicae(L.)的研究中，將EPG 與電鏡技術(shù)結(jié)合，將蚜蟲的口針切除，發(fā)現(xiàn)只有發(fā)生韌皮部的波形(E 波)后切斷口針才會(huì)有汁液流出，并從顯微照片上看出，口針頂端已經(jīng)刺穿篩管的原生質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)腔。研究人員在記錄B 型煙粉虱的取食行為中發(fā)現(xiàn)下唇的縮短長(zhǎng)度與口針進(jìn)入植物組織的長(zhǎng)度一致。結(jié)合高放大率攝像機(jī)，在分屏的屏幕上可以同時(shí)看到粉虱下唇和EPG 波形，下唇長(zhǎng)度的改變可以被測(cè)定并與特定的EPG 波形相結(jié)合，因此某一特定的波形發(fā)生時(shí)，口針進(jìn)入植物組織的長(zhǎng)度就可以被測(cè)量出來(Jiang and Walker，2001)。本研究中使用的體視顯微鏡及人工飼料模型，可以直觀的觀察綠盲蝽實(shí)時(shí)取食行為，省去作組織切片觀察目標(biāo)昆蟲口針位置的繁瑣過程。

EPG 技術(shù)在刺吸式昆蟲與植物相互關(guān)系、植物抗性機(jī)理及昆蟲傳毒機(jī)理研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。植物的抗蟲性一直被譽(yù)為最有效、最經(jīng)濟(jì)的害蟲防治措施，篩選對(duì)盲蝽具有較高抗性的棉花品種也具有重要意義。解析綠盲蝽在食料模型上波形，為今后抗性品種的篩選鑒定奠定了一定的基礎(chǔ)。

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