益肺通絡(luò)顆粒的主要藥效學研究

歐 艷，楊 勵，左亞杰，曾建國，劉艷科

（1.長沙市中心醫(yī)院，湖南 長沙410004；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410002）

結(jié)核病是一種嚴重危害人民健康的慢性傳染病，目前全球有約20億人被感染，每年新出現(xiàn)結(jié)核病患者約800～1 000萬[1]，每年因結(jié)核病死亡人數(shù)約為200～300萬。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，全球結(jié)核病總耐藥率為20.0%，耐多藥率為5.3%，估計全球耐多藥結(jié)核病已達50萬例[2-3]。我國結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬，占全球發(fā)病的14.3%，居世界第2位，其中肺結(jié)核患者耐多藥率為6.8%。

益肺通絡(luò)顆粒是我院中醫(yī)專家劉艷科教授的經(jīng)驗方，國家“十一五”科技重大專項研究—中醫(yī)藥治療肺結(jié)核臨床科研基地建設(shè)的基礎(chǔ)研究中的自擬處方(“益肺通絡(luò)方”已申請?zhí)幏綄＠?，發(fā)文序號2011041400413580)，由黃精、白及、太子參、百部、矮地茶、紫花地丁、大薊等11味藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、化瘀通絡(luò)、去腐生新的功效，主治氣陰兩虛夾瘀型耐多藥肺結(jié)核。本文參考《中藥新藥研究指南》[4]的要求及相關(guān)實驗方法[5]，對益肺通絡(luò)顆粒進行了抗結(jié)核、抑制超敏、增強免疫及止咳等方面的研究，旨在為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 小白鼠，昆明種，SPF級，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物合格證號：HNASLKJ20102986。

1.1.2 藥物 益肺通絡(luò)顆粒（湖南中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院制劑室提供，批號：20110625，生藥含量：3.13 g生藥/g，成人日用量：75.12 g生藥/d）；異煙肼片 （0.1 g/片，山西云鵬制藥有限公司，批號：100402）；鹽酸左旋咪唑片（25 mg/片，南京白敬宇制藥廠，批號：100101）；枸櫞酸噴托維林片（25 mg/片，河南省安陽市第一制藥廠，批號：100502）。強毒人型結(jié)核菌（H37RV）菌株，中國疾病預防控制中心；2，4-二硝基氯苯（安徽八一化工股份有限公司，醫(yī)藥級，批號：093356）；印度墨汁（北京篤信精細制劑廠，批號：0040823）；濃氨水（南寧第二化工廠，批號：091023）。

1.1.3 儀器 721分光光度計，上海第三分析儀器廠。

1.1.4 藥物配制方法和實驗動物分組 各藥物均臨用前用蒸餾水配制成所需濃度的混懸藥液。益肺通絡(luò)組低、中、高劑量分別為含生藥6、12、24 g/kg。實驗動物隨機分為6組：第1組為正常對照組，第2組為模型對照組，灌胃給等體積蒸餾水；第3、4、5組分別為益肺通絡(luò)低、中、高劑量組；第6組為陽性藥物組；或5組：空白對照組，灌胃給等體積蒸餾水；益肺通絡(luò)低、中、高劑量組；陽性藥物組。每組動物12只，給藥體積：20 mL/kg，均灌胃給藥。

1.2 方法

1.2.1 對結(jié)核桿菌感染動物的治療作用 參考文獻方法[6]，取健康昆明種小鼠72只，雌雄各半，體質(zhì)量（17.1±0.6）g。適應(yīng)環(huán)境后，按性別、體質(zhì)量分層，隨機分為6組，每組12只。除空白對照組小鼠外，其他各組小鼠尾靜脈注射接種2 mg/mL人型結(jié)核桿菌（H37RV）0.2 mL/只。感染后第3日，各組灌胃給藥，異煙肼組給予0.75 g/kg異煙肼片，連續(xù)3 d。連續(xù)3周觀察各組小鼠死亡情況，計算各組小鼠的生存時間，稱量肺、肝、脾質(zhì)量，測算肺、肝、脾臟器指數(shù)，臟器指數(shù)（mg/g）=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.2.2 對遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響 參考文獻方法[7]，取健康昆明種小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（20.0±1.2）g。小鼠腹部剪毛約4 cm2，適應(yīng)環(huán)境后，按性別、體質(zhì)量分層，隨機分為5組，每組12只。連續(xù)給藥10 d，陽性藥物組為0.75 g/kg鹽酸左旋咪唑片。給藥第4天，將1%2，4-二硝基氯苯50μL均勻涂抹于腹部去毛部位，給藥第9天，將1%2，4-二硝基氯苯10μL均勻涂抹于小鼠右耳雙面進行攻擊，攻擊后24 h，處死，用直徑8 mm的打孔器取下雙側(cè)耳片(取對稱位置)，分別稱其質(zhì)量，以兩耳片質(zhì)量之差作為腫脹度。

1.2.3 對正常小鼠非特異性免疫功能的影響 參考文獻方法[8]155，取健康昆明種小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（20.2±1.4）g。適應(yīng)環(huán)境后，按性別、體重分層，隨機分為5組，每組12只。連續(xù)灌胃給藥10 d，陽性藥物組為0.75 g/kg鹽酸左旋咪唑。末次給藥30 min后，稱取體質(zhì)量，尾靜脈注射印度墨汁0.1 mL/10 g，注射后2 min（t2min）、20 min(t20min)分別從眼眶后靜脈叢采血20μL，溶于2 mL，0.1%Na2C03溶液中搖勻，在波長610 nm下比色，測定光密度（以下分別用OD2min和OD20min來表示2 min和20 min所取血樣的光密度）。取血完畢，用頸椎脫臼法處死小鼠，取其肝臟、脾臟，稱質(zhì)量。按下列公式計算廓清指數(shù)（K）及校正廓清指數(shù)（α）進行統(tǒng)計學計算。

1.2.4 對小鼠氨水引咳試驗的影響 參考文獻方法[8]424，取健康昆明種小鼠足量，禁食不禁水12 h，置于500 mL燒杯中，在直徑小于燒杯的表面皿內(nèi)放一棉球，上面加蓋篩網(wǎng)，向棉球中注入0.4 mL氨水（25%），迅速將燒杯倒置，使得氨水刺激小鼠引發(fā)咳嗽，以小鼠腹肌強烈收縮，同時張嘴呼氣為準。以1 min內(nèi)咳嗽次數(shù)大于或等于3次判定為引咳初篩合格。

取上述引咳初篩合格的小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（20.1±1.2）g。按性別、體質(zhì)量分層，隨機分為5組，每組12只。連續(xù)灌胃給藥10 d，陽性藥物組為50 mg/kg枸櫞酸噴托維林片。末次給藥后30 min，依照上法以氨水刺激小鼠引發(fā)咳嗽。觀察并記錄各組小鼠引咳潛伏期（從倒置燒杯至發(fā)生咳嗽的時間），以及小鼠3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)，3 min內(nèi)不咳者潛伏期以3 min計。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有資料應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，采用“±s”表示，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對結(jié)核桿菌感染動物死亡時間的影響

小鼠死亡時間觀察結(jié)果顯示，模型對照組小鼠感染人型結(jié)核桿菌（H37RV）后第15天開始出現(xiàn)死亡，至第23天實驗結(jié)束時僅有1只小鼠存活。益肺通絡(luò)顆粒不同劑量組小鼠存活時間均高于模型對照組，存活率分別達到16.7%、50.0%、83.3%，對人型結(jié)核桿菌（H37RV）感染小鼠具有明顯的保護作用，且存在劑量等效關(guān)系。結(jié)果見表1。

表1 益肺通絡(luò)顆粒對結(jié)核桿菌感染小鼠死亡時間的影響

2.2 對結(jié)核桿菌感染小鼠臟器指數(shù)的影響

各組小鼠肺、肝、脾臟器指數(shù)測算結(jié)果顯示，小鼠感染人型結(jié)核桿菌（H37RV）后，肺、肝、脾臟器重量顯著增加（P＜0.01），中、高劑量益肺通絡(luò)顆粒對感染小鼠肺、肝、脾臟器均存在顯著的保護作用（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 益肺通絡(luò)顆粒對結(jié)核桿菌感染小鼠臟器指數(shù)的影響（±s）

表2 益肺通絡(luò)顆粒對結(jié)核桿菌感染小鼠臟器指數(shù)的影響（±s）

注：與空白對照組比較##P＜0.01；與模型對照組比較**P＜0.01。

劑量（g/kg）組 別空白對照組模型對照組益肺通絡(luò)低組益肺通絡(luò)中組益肺通絡(luò)高組異煙肼組——6 12 24 0.75例數(shù)12 12 12 12 12 12肺臟指數(shù)5.24±0.66 8.82±0.82##8.67±0.56 8.01±0.65**7.31±0.35**7.11±1.16**肝臟指數(shù)5.13±0.81 8.29±0.75##8.06±0.85 7.43±1.03**6.49±0.86**7.13±1.10**脾臟指數(shù)0.37±0.07 0.52±0.09##0.48±0.06 0.43±0.10**0.36±0.07**0.37±0.05**

2.3 對遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響

與模型組比較，中、高劑量益肺通絡(luò)顆粒對小鼠耳腫脹度有顯著的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），說明其對小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)有較好的抑制作用。結(jié)果見表3。

表3 益肺通絡(luò)顆粒對小鼠耳腫脹度的影響 （±s）

表3 益肺通絡(luò)顆粒對小鼠耳腫脹度的影響 （±s）

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別模型組益肺通絡(luò)低組益肺通絡(luò)中組益肺通絡(luò)高組左旋咪唑組劑量（g/kg）—6 12 24 0.75例數(shù)12 12 12 12 12腫脹度（mg）4.3±0.90 3.7±1.16 3.2±1.14*2.6±0.84**2.8±1.38**

2.4 對正常小鼠非特異性免疫功能的影響

與空白組比較，中、高劑量益肺通絡(luò)顆粒小鼠炭粒廓清指數(shù)和校正廓清指數(shù)均顯著高于空白對照組（P＜0.01），說明益肺通絡(luò)顆粒能顯著增強小鼠的非特異性免疫功能。結(jié)果見表4。

表4 益肺通絡(luò)顆粒對小鼠炭粒廓清速率的影響 （±s）

表4 益肺通絡(luò)顆粒對小鼠炭粒廓清速率的影響 （±s）

注：與空白對照組比較**P＜0.01。

組 別空白對照組益肺通絡(luò)低組益肺通絡(luò)中組益肺通絡(luò)高組左旋咪唑組劑量（g/kg）—6 12 24 0.75例數(shù)12 12 12 12 12廓清指數(shù)(k，×10-2)1.87±0.27 2.12±0.37 2.74±0.68**2.96±0.42**2.89±0.53**校正廓清指數(shù)(α)4.59±0.34 5.06±0.81 5.88±1.34**6.16±1.07**6.26±0.75**

2.5 對小鼠氨水引咳試驗的影響

與模型組比較，中、高劑量益肺通絡(luò)顆粒能顯著延長小鼠氨水引咳的潛伏期（P＜0.05，P＜0.01），減少3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)（P＜0.05，P＜0.01），說明益肺通絡(luò)顆粒具有較好的止咳作用。結(jié)果見表5。

表5 益肺通絡(luò)顆粒對小鼠咳嗽次數(shù)的影響 （±s）

表5 益肺通絡(luò)顆粒對小鼠咳嗽次數(shù)的影響 （±s）

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別模型組益肺通絡(luò)低組益肺通絡(luò)中組益肺通絡(luò)高組左旋咪唑組劑量（g/kg）—6 12 24 0.75例數(shù)12 12 12 12 12引咳潛伏期(s)35.5±7.7 40.3±6.7 43.1±9.8*46.9±9.4**49.2±10.0**3 min咳嗽次數(shù)30.8±7.6 28.8±6.5 23.4±6.9*18.1±4.4**14.8±8.9**

3 討論

臨床研究和藥理實驗研究證明，很多單味中藥本身就有不同程度的抗結(jié)核桿菌作用，如貓爪草、苦參、大蒜、狼毒、水車前、夏枯草、白及、百部、黃連、黃芩、蒼術(shù)、淫羊藿、遠志、北豆根、龍舌草、黃芪、冬蟲夏草、葎草等[9-11]?！耙娣瓮ńj(luò)方”以黃精、白及、太子參為方中主藥，黃精補中益氣、潤心肺、強筋骨，白及收斂止血、消腫生肌、補肺，太子參補益脾肺、益氣生津，現(xiàn)代藥理研究表明三藥對結(jié)核桿菌有抑菌作用，且黃精有增強免疫功能、抗衰老、抗疲勞、耐缺氧作用，尤擅長于肺結(jié)核治療，體外試驗其對結(jié)核桿菌有明顯抑制作用。百部、矮地茶、紫花地丁、大薊化痰、殺蟲、消瘀、生新；天冬、款冬花、鱉甲清潤肺氣、滋陰軟堅、增強免疫；絲瓜絡(luò)通經(jīng)絡(luò)、和血脈、化痰順氣。上述諸藥合用，共奏滋陰潤肺、殺蟲祛痰、化瘀生新之功。

研究報道中西藥結(jié)合在控制肺結(jié)核臨床癥狀(如咯血、咳嗽、發(fā)熱)[12-13]、促進病灶吸收[14]、提高涂陽肺結(jié)核的轉(zhuǎn)陰率[15]等方面比單用化療藥物效果好。另外，中西藥結(jié)合能明顯降低化療藥物的毒副作用，減輕肝功能損傷，防止血尿酸升高，提高患者的順應(yīng)性。對于耐藥性肺結(jié)核的治療，中西醫(yī)結(jié)合也?？扇〉煤芎玫寞熜15-16]。臨床研究報道[17]“益肺通絡(luò)方”聯(lián)合化療藥物治療耐多藥肺結(jié)核在促進痰結(jié)核分枝桿菌陰轉(zhuǎn)率、肺部病灶吸收有效率均優(yōu)于單純西藥組，強化期影像學上均有不同程度的好轉(zhuǎn)與吸收，藥物不良反應(yīng)較輕，患者可以耐受。可用于肺結(jié)核?、笮屠^發(fā)性肺結(jié)核（浸潤性、慢性纖維空洞型）病，配合西藥化療減毒增效，減少耐藥性，增強抗結(jié)核作用。

本實驗結(jié)果表明，益肺通絡(luò)顆粒對人型結(jié)核桿菌（H37RV）感染小鼠具有顯著的保護作用，對氨水引起的小鼠咳嗽有顯著的抑制作用。同時，能顯著抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，增強小鼠的非特異性免疫功能。為有效控制益肺通絡(luò)顆粒的質(zhì)量，通過研究建立了益肺通絡(luò)顆粒的質(zhì)量控制方法，采用薄層色譜對黃精、紫花地丁和百部進行定性鑒別，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；采用高效液相色譜(HPLC)法對矮地茶中主要成分巖白菜素進行含量測定，含巖白菜素不少于1.25 mg/g[18]。

從益肺通絡(luò)顆粒組方藥物的文獻資料來看，該方重在益氣養(yǎng)陰、祛瘀通絡(luò)、化痰止咳，對機體免疫功能有一定的增強作用。針對該方的藥效學試驗主要在驗證其對于機體免疫功能的影響，止咳效果，以及其對于結(jié)核桿菌損害機體的保護作用，而沒有進行該藥體內(nèi)抑菌作用的詳細觀察，所以第一項實驗僅設(shè)計3 d給藥，給藥時間過短，且未進行臟器活菌檢查以及肺臟病理學檢查，僅從動物存活數(shù)和臟器指數(shù)觀察了益氣通絡(luò)顆粒對于結(jié)核桿菌損害的保護作用。但該藥體外試驗顯示有明顯抑制結(jié)核分枝桿菌作用，且尤對耐多藥結(jié)核分枝桿菌敏感[19]，是否可設(shè)計活菌培養(yǎng)計數(shù)法判斷結(jié)核菌是否存活以及結(jié)核菌感染小鼠感染治療作用的評價：肺組織勻漿培養(yǎng)；注射部位皮下結(jié)節(jié)、破潰；遲發(fā)性過敏反應(yīng)或肺、肝、脾感染結(jié)核桿菌的病理表現(xiàn)等，來驗證益肺通絡(luò)顆粒抗結(jié)核作用，有待以后的研究證實。

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