鳳尾草不同溶媒提取功能成分的抗菌效果比較

劉湘紅，劉遠超，韓曉萍，王小鶯

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江西南昌330045)

鳳尾草（Pteris multifida Poir） 屬于鳳尾蕨科、鳳尾蕨屬，別名雞爪草、井欄草、小葉鳳尾草，多年生草本，生長于半陰濕的巖石及墻角石隙中。鳳尾蕨全草都可供藥用，主要成分含黃酮類、多元酸以及對映貝殼杉烷型二萜[1]等生理活性物質(zhì)，具有清熱利濕、抗菌消炎、消腫止痛等功效，多用于治痢疾和止瀉[2]。民間及臨床用全草治療痢疾、外傷出血、燙傷、燒傷以及扁桃體炎、肝炎等，其根莖還可用于治療糖尿病、抗腫瘤[2]。目前，鳳尾草的抗菌作用雖有文獻記載，但國內(nèi)外相關(guān)報道還是較少。鳳尾草功能成分提取近年來逐步有些報道，但多數(shù)用水和乙醇提取[1,3]。此外，還有研究用甲醇法[4]、堿液法[5]、色譜分離等提取功能成分。

本研究以鳳尾草為原料,以乙醇和丙酮為溶劑提取及蒸餾水煎煮，比較提取的功能成分抗菌效果，旨在探索較好的提取方法，為鳳尾草藥效的開發(fā)和利用提供新思路。

1 材料

1.1 藥材

鳳尾草：全草于2011年6月15日采集于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，清洗干燥粉碎后備用。

1.2 試驗菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、沙門氏菌(Salmonella)和嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、大腸桿菌(Escherichia coli)，由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)教研室分離鑒定并保存。

1.3 培養(yǎng)基

普通肉湯培養(yǎng)基，肉湯瓊脂培養(yǎng)基用于細菌培養(yǎng)。

2 方法

2.1 鳳尾草提取液制備

2.1.1 鳳尾草醇提液的制備 取鳳尾草全草洗凈，60℃干燥，粉碎過40目篩，精密稱取粗粉5g，裝于濾紙包內(nèi)，置于索氏提取器中，用體積分數(shù)60%的乙醇熱回流提取1 h，溫度控制在60℃[3]，料液比1：20的相同條件下浸提3次，每次浸提1h，過濾合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)濃縮(溫度控制在60℃)，即得鳳尾草乙醇提取液，濃度為0.7g生藥/ml。

2.1.2 鳳尾草丙酮提取液的制備按上述方法用60%的丙酮替代60%的乙醇熱回流提取濃縮，即獲得鳳尾草的丙酮提取液，濃度為0.943g生藥/ml。

2.1.3 鳳尾草水煎液的制備精密稱取鳳尾草干燥粉末5g，加蒸餾水浸泡20min后，以料水比1:30，水煎3次，每次1h，過濾，合并水煎液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃下蒸發(fā)濃縮獲得濃度為0.442 g生藥/ml的鳳尾草水煎液。

將以上三份提取液分別用細菌過濾器過濾后將濾液置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，使用期限為一周?/p>

2.2 受試菌菌液的制備

將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌的新鮮培養(yǎng)物接種于普通瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16~18h，次日挑選單個菌落1～2個接種于2ml普通肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫箱16～18h培養(yǎng)后取出。用平皿法測定細菌濃度。臨用前將菌液用肉湯培養(yǎng)基稀釋成菌液濃度為105CFU/ml，備用。

2.3 MIC值測定

按試管二倍稀釋法測定MIC值。取滅菌小試管30支，每10支一組分別排列試管架上，并將每組試管按照1至10編號，每種菌都三次重復(fù)。放置37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24h后取出觀察細菌生長狀況。以能抑制細菌生長的最小濃度為提取液對該細菌的最低抑菌濃度（MIC）。

3 結(jié)果與分析

本實驗所選用水煎煮和用乙醇、丙酮回流提取所得的提取液，對臨床分離的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌的體外抑菌結(jié)果的MIC見表1。

表1 鳳尾草提取液最低抑菌濃度結(jié)果（mg生藥/ml）

由表1可知，三種提取液對革蘭氏陰性、陽性菌均有抑制作用，但抑制效果不同。丙酮提取液的抑菌活性最強，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及嗜水氣單胞菌的MIC均為29.48（mg生藥/ml）。其次為乙醇提取液，水煎液效果最差。由此可知，用乙醇和丙酮熱回流提取比傳統(tǒng)的水煎法提取鳳尾草的功能成分抗菌效果更好。

4 討論

水煎液效果差的原因可能與煎煮湯劑所用水量的多少、火候的大小及時間的長短等有關(guān)，這些因素會直接影響藥物有效成分溶出，也可能煎煮對功能成分的破壞有關(guān)，因為傳統(tǒng)的煎煮法溫度達到100℃。劉國凌報道，溫度對鳳尾草水溶性黃酮的浸提有顯著的提高，但溫度超過90℃以后，得率稍有下降，可能會導(dǎo)致部分黃酮類物質(zhì)的分解而使總黃酮得率下降[6]。吳英華報道，在提取因子中，溫度對鳳尾草總黃酮提取率影響最大。在試驗條件下，隨溫度的升高，鳳尾草總黃酮提取率逐漸增大，但當(dāng)溫度達到60℃以后，溫度再升高，總黃酮的提取率反而下降[3]。

不同方法提取的功能成分會有所不同，可能會對抗菌效果產(chǎn)生影響。近年來，隨著鳳尾草的深入研究,分離提取得到更多的活性成分。據(jù)報道，劉清飛首次從鳳尾草根莖中分離提取到多個化合物，鑒定出其中4個。除β谷甾醇外，其他3個為四環(huán)二萜貝殼杉烷(烯)類化合物，均為首次從鳳尾草根莖中分離到[1]。秦波等人從鳳尾草的丙酮和20%乙醇提取物中，分離得出一個倍半萜苷和6個黃酮類化合物，其中有4種黃酮類化合物為首次分離得到[7]。

中藥提取物本身有顏色，對MIC測定的實驗結(jié)果的判斷有一定影響。提取方法獲得的藥物是否通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機溶劑去除的干凈，可能影響實驗結(jié)果。

[1]劉清飛,秦明珠.鳳尾草根莖的化學(xué)成分研究.中草藥[J],2002,33(2):1132-1141.

[2]楊春澎.藥用植物學(xué).[M].1997,上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社.

[3]吳英華,蔡小華,任鳳蓮.鳳尾草中總黃酮的提取工藝研究.光譜實驗室[J],2008,25(2):195-198.

[4]王文蜀,王志騫,周亞偉.鳳尾草化學(xué)成分研究.中藥材[J].2008,31(8)：1165-1167.

[5]余有貴,趙良忠,段林東.鳳尾草功能成分提取與抗菌效果研究.中國飼料[J].2004(023):23-24.

[6]劉國凌,寧正祥,彭小紅.鳳尾草黃酮類化合物的水提工藝條件研究.食品科學(xué)[J].2008,29(8):286-288

[7]QINBo.ZHUDa-Yuan,JIANGShan–Hao,et al,Chemical Constituents of Pterismultifida and Their Inhibito2ry Effectson Growth of Rat Pr ostatic Ep ithelial Cells in vitro[J].Chinese Journal of NaturalMedicines,2006,4(6):431.