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    黃芪與不同劑量柴胡配伍的退熱作用及機(jī)制的探討

    2013-06-05 14:35:27趙榮華高秀蘭謝鳴張敬升
    世界中醫(yī)藥 2013年10期
    關(guān)鍵詞:下丘腦脾虛小劑量

    趙榮華高秀蘭謝 鳴張敬升

    (1北京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)方劑學(xué)學(xué)科,北京,100029;2山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校,萊陽(yáng),265200)

    黃芪與不同劑量柴胡配伍的退熱作用及機(jī)制的探討

    趙榮華1高秀蘭2謝 鳴1張敬升1

    (1北京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)方劑學(xué)學(xué)科,北京,100029;2山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校,萊陽(yáng),265200)

    目的:探討黃芪與不同劑量柴胡配伍對(duì)脾虛發(fā)熱大鼠模型的退熱作用及機(jī)制。方法:雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、脾虛發(fā)熱組、芪柴大、中、小劑量組、柴胡組共6組。采用飲食失節(jié)+游泳疲勞+LPS制備大鼠脾虛發(fā)熱模型。實(shí)驗(yàn)第17d開(kāi)始,各給藥組大鼠分別按劑量4.56 g/kg、2.95 g/kg、2.41 g/kg、2.41 g/kg給予灌胃,正常組和脾虛發(fā)熱組給予同體積蒸餾水,每日1次,連續(xù)6 d。第22天模型組和各給藥組ip LPS(80μg/kg),正常對(duì)照組ip等量生理鹽水。觀(guān)測(cè)各組大鼠ip后不同時(shí)間點(diǎn)的體溫,測(cè)定血中細(xì)胞因子和下丘腦體溫調(diào)節(jié)遞質(zhì)的含量。結(jié)果:與正常組相比,脾虛發(fā)熱組大鼠在ip LPS后各點(diǎn)體溫均見(jiàn)不同程度升高,60 min和220 min時(shí)升高明顯(P<0.05);血IL-2顯著升高(P<0.05);下丘腦cAMP和PGE2顯著升高(P<0.05),AVP呈下降趨勢(shì)。與脾虛發(fā)熱模型組相比,各給藥組大鼠體溫均出現(xiàn)不同程度下降(P<0.05),下丘腦PGE2或AVP呈現(xiàn)降低或升高趨勢(shì),其中柴胡組和芪柴小劑量組的體溫下降明顯,下丘腦IL-1β顯著降低(P<0.05),芪柴大劑量組血IL-1β顯著升高(P<0.05)。與芪柴大劑量組比,芪柴中、小劑量組及柴胡組血IL-1β均顯著降低(P<0.05),芪柴中、小劑量組血IL -2顯著升高(P<0.05)。結(jié)論:黃芪配伍柴胡不同劑量及單用大劑柴胡對(duì)脾虛發(fā)熱模型均有不同程度的退熱作用,其退熱機(jī)制可能與降低中樞發(fā)熱遞質(zhì)PGE2和升高AVP有關(guān),黃芪與小劑柴胡配伍和單純大劑柴胡的退熱作用可能還涉及到中樞IL-1β的降低。

    黃芪;柴胡;配伍;脾虛發(fā)熱;退熱

    補(bǔ)中益氣湯是中醫(yī)治療脾虛發(fā)熱的代表方劑,方中較大劑量的黃芪與小劑量柴胡配伍是益氣退熱的主要藥對(duì)。柴胡微寒、苦辛,具有解表退熱、疏肝解郁和升陽(yáng)等功效。根據(jù)方藥病證相關(guān)的原理,方藥的功效不僅與其所治證候有關(guān),也與藥物的使用劑量有關(guān)[1]。之前我們的研究發(fā)現(xiàn)大劑量單味黃芪對(duì)脾虛發(fā)熱證模型具有一定的退熱作用[2],本文則進(jìn)一步考察大劑量黃芪與不同劑量的柴胡配伍對(duì)該模型的退熱效用及機(jī)制。

    1 材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性wistar大鼠,200~220 g,60只。購(gòu)于北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)-2006-0009。

    1.2 藥材 黃芪、柴胡由北京同仁堂藥業(yè)股份有限公司提供,并經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定教研室張媛教授鑒定為豆科植物內(nèi)蒙黃芪的干燥根和傘形科植物柴胡的干燥根。實(shí)驗(yàn)用藥液制備:黃芪24 g,分別與柴胡27 g、9 g、3 g配伍,組成三個(gè)不同配方(簡(jiǎn)稱(chēng)為芪柴大劑、中劑、小劑);柴胡27 g設(shè)為單味柴胡方。各方均按常規(guī)湯藥制備方法,即取藥材加5倍體積冷水浸泡30 min,加熱煮沸后煎煮30 min,傾出藥液;殘?jiān)?倍體積水煮沸后煎煮30 min;合并先后兩次的煎煮液,濃縮成1 g(生藥)/mL的濃度,備用。

    1.3 試劑 LPS注射液的制備:脂多糖(Escherichia coli endotoxin 055B5,L2880,LPS),Sigma公司生產(chǎn)。無(wú)菌條件下,用生理鹽水將LPS配成濃度為20μg/m L的LPS注射液,備用。IL-1-RIA試劑盒(批號(hào):20111216)、IL-2-RIA試劑盒(批號(hào):20111223),PGE2-RIA試劑盒(批號(hào):20111219)、cAMP-RIA試劑盒(批號(hào):20111221)、AVP-RIA試劑盒(批號(hào):20111225)均由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

    1.4 儀器 電腦數(shù)字溫度計(jì)MC-3B型:OMROM歐姆龍(大連)有限公司生產(chǎn)。精密度:0.1°C。塑料鋼化筒(執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn):Q/WHC02-2002)。

    2 方法

    2.1 脾虛發(fā)熱證動(dòng)物模型的復(fù)制 采用飲食失節(jié)+游泳疲勞+腹腔注射LPS法[3]。

    2.2 分組與處理 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于25℃室溫下適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d,第4~5 d連續(xù)兩次肛溫波動(dòng)超過(guò)0.5℃或單次肛溫超過(guò)39℃的大鼠剔除不用,取兩次肛溫的平均值作為基礎(chǔ)體溫。符合條件的大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、脾虛發(fā)熱模型組(模型組)、黃芪柴胡大劑量組(簡(jiǎn)稱(chēng)芪柴大劑組)、黃芪柴胡中劑量組(芪柴中劑組)、黃芪柴胡小劑量組(芪柴小劑組)、單純柴胡大劑量組(柴胡組)共6組,每組10只。除正常對(duì)照組外其余各組大鼠采用飲食失節(jié)+游泳疲勞法制備脾虛模型[3]。模型復(fù)制第17 d開(kāi)始,芪柴大劑量組、芪柴中劑量組、芪柴小劑量組、柴胡組四組大鼠分別按劑量4.56 g/kg、2.95 g/kg、2.41 g/kg、2.41 g/kg(相當(dāng)于生藥材含量)給予相應(yīng)的藥物灌胃,正常對(duì)照組和脾虛發(fā)熱模型組給予同體積蒸餾水,1次/d,連續(xù)6 d。于造模第22天的上午8:00,脾虛發(fā)熱模型組和各給藥組大鼠腹腔注射LPS(80μg/kg),正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。腹腔注射后,各組灌胃給藥1次。分別測(cè)定各組大鼠LPS注射后不同時(shí)間點(diǎn)的肛溫;最后一次肛溫測(cè)定后即刻斷頭取血,2500 r/min離心15 min,取血清,-20℃保存;低溫條件下取下丘腦。

    2.3 觀(guān)測(cè)指標(biāo)

    2.3.1 體溫 各組大鼠LPS注射后30 min、60 min、120 min、180 min、220 min的肛溫,測(cè)算各組△T(實(shí)測(cè)體溫與基礎(chǔ)體溫之間的差)并繪制平均體溫曲線(xiàn)。

    2.3.2 細(xì)胞因子 血清IL-1β和IL-2:放射免疫法測(cè)定,按試劑盒說(shuō)明操作。

    2.3.3 下丘腦熱調(diào)節(jié)遞質(zhì) PGE2、cAMP、AVP:取下丘腦組織0.3~0.5 g,濾紙吸干組織液和血液后,加生理鹽水1 mL(含0.05 mol/L醋酸20μL),制備勻漿,3000 r/min 10 min,取上清液;加入0.05 mol的NaOH 25μL(pH 7.4)。取上清液10μL加入定量的蛋白試劑中,采用分光光度法測(cè)定蛋白含量;其余置4℃保存,測(cè)定前用1 mL醋酸緩沖液溶解,采用放免法檢測(cè)[4]。

    3 結(jié)果

    3.1 黃芪與不同劑量柴胡配伍對(duì)脾虛發(fā)熱大鼠體溫的影響 結(jié)果見(jiàn)表1。如表1所示,與正常對(duì)照組相比,脾虛發(fā)熱模型組大鼠體溫升高,在60 min、220 min時(shí)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與脾虛發(fā)熱模型組相比,各給藥組大鼠體溫均呈不同程度降低,其中芪柴大劑組體溫在60 min、120 min、220 min時(shí)下降明顯(P<0.05),芪柴中劑組、芪柴小劑組及柴胡組在60 min、180 min、220 min時(shí)的體溫均下降明顯(P<0.05)。

    表1 黃芪配伍柴胡不同劑量對(duì)LPS誘導(dǎo)脾虛發(fā)熱大鼠△T變化的影響(±s)

    表1 黃芪配伍柴胡不同劑量對(duì)LPS誘導(dǎo)脾虛發(fā)熱大鼠△T變化的影響(±s)

    注:與正常對(duì)照組比,*P<0.05;與模型組相比,△P<0.05;與柴胡組比,▲P<0.05。

    30 min 60 min 120 min 180 min 220 min正常對(duì)照組10-0.19±0.53-0.41±0.51-0.60±0.27-0.35±0組別例數(shù)不同時(shí)間點(diǎn)的△T .22-0.39±0.48模型組10 0.32±0.73 1.05±0.60*-0.09±0.91-0.05±1.16 0.81±0.81*芪柴大劑組10 0.19±0.54-0.64±0.76△-0.86±0.64△-0.48±1.47▲-1.83±0.94*△芪柴中劑組10-0.38±0.44△-0.38±1.10△0.09±1.20▲-1.08±1.21△-1.77±0.69*△芪柴小劑組10-0.11±0.79▲-0.43±0.56△-1.23±1.09△-1.22±1.15△-1.97±1.32*△柴胡組10 0.81±1.02△-0.72±0.71△-0.95±0.88△-1.84±0.74*△-2.04±0.94*△

    3.2 黃芪與不同劑量柴胡配伍對(duì)脾虛發(fā)熱大鼠血中細(xì)胞因子的影響 結(jié)果見(jiàn)表2。如表2所示,與正常組相比,脾虛發(fā)熱模型組大鼠血IL-2明顯升高(P<0.05),IL-1β見(jiàn)降低趨勢(shì)(P>0.05)。與脾虛發(fā)熱模型組相比,芪柴大劑組大鼠IL-1β升高(P<0.05)、IL-2有降低趨勢(shì)(P>0.05),芪柴中劑和小劑量組IL-2呈升高趨勢(shì)(P>0.05),芪柴中劑、小劑及柴胡組IL-1β均無(wú)明顯變化。與芪柴大劑組比,芪柴中劑和小劑組的IL-1β均見(jiàn)降低、IL-2均見(jiàn)升高(P<0.05)。與柴胡組相比,芪柴大劑組IL-1β明顯升高(P<0.05)。

    表2 黃芪與不同劑量柴胡配伍對(duì)脾虛發(fā)熱大鼠免疫因子的影響(±s,m L-1)

    表2 黃芪與不同劑量柴胡配伍對(duì)脾虛發(fā)熱大鼠免疫因子的影響(±s,m L-1)

    注:與正常對(duì)照組比,*P<0.05;與模型組相比,△P<0.05;與芪柴大劑量組比,▲P<0.05;與柴胡組比,□P<0.05。

    組別例數(shù)IL-2(ng)IL-1β(ng )9 5.82±0.68 0.28±0.34模型組9 6.89±0.86*0.24±0.08芪柴大劑量8 6.07±1.06 0.32±0.10△□芪柴中劑量8 7.54±0.98*▲0.25±0.05▲芪柴小劑量8 7.47±1.89*▲0.25±0.04▲柴胡組8 6.46±0.52 0.26±0.03對(duì)照組▲

    表3 黃芪與不同劑量柴胡配伍對(duì)脾虛發(fā)熱大鼠下丘腦相關(guān)遞質(zhì)的影響(±s,mg-1)

    表3 黃芪與不同劑量柴胡配伍對(duì)脾虛發(fā)熱大鼠下丘腦相關(guān)遞質(zhì)的影響(±s,mg-1)

    注:與對(duì)照組比,*P<0.05;與模型組相比,△P<0.05;與柴胡組比,▲P<0.05。

    組別例數(shù)下丘腦熱調(diào)節(jié)相關(guān)遞質(zhì)IL-1β(ng)AVP(pg)PGE2(ng)CAMP(pmol )2.35±0.62 0.57±0.07 0.37±0.10模型組9 0.05±0.02▲2.19±0.43 0.66±0.07*0.51±0.10*芪柴大劑量8 0.04±0.02*2.69±0.67 0.63±0.05*0.46±0.07芪柴中劑量8 0.04±0.01▲2.38±0.83 0.65±0.03*0.51±0.10*芪柴小劑量8 0.03±0.01*△2.28±0.63 0.62±0.05*0.55±0.12*柴胡組8 0.03±0.01*△2.22±0.27 0.63±0.05*0.49±0.10對(duì)照組9 0.05±0.01▲*

    3.3 黃芪與不同劑量柴胡配伍對(duì)脾虛發(fā)熱大鼠下丘腦發(fā)熱調(diào)質(zhì)的影響 結(jié)果見(jiàn)表3。如表3所示,與正常組相比,脾虛發(fā)熱模型組大鼠下丘腦cAMP和PGE2含量均明顯升高(P<0.05),AVP呈下降趨勢(shì)。與脾虛發(fā)熱模型組相比,芪柴各劑量組和柴胡組大鼠下丘腦PGE2/AVP分別呈降低/升高趨勢(shì)(P>0.05),芪柴小劑量及柴胡組下丘腦IL-1β含量降低明顯(P<0.05)。與柴胡組相比,芪柴中劑量組大鼠IL-1β含量顯著升高(P<0.05)。其余指標(biāo)各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    4 討論

    體溫調(diào)節(jié)的高級(jí)中樞主要位于視前區(qū)下丘腦前部(POAH),由正負(fù)兩種遞質(zhì)相互作用所調(diào)節(jié),其中正調(diào)節(jié)遞質(zhì)有環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、前列腺素E2(PGE2)、氧化亞氮(NO)等,負(fù)調(diào)節(jié)遞質(zhì)有精氨酸加壓素(AVP)等。當(dāng)外周致熱信號(hào)傳入中樞后,啟動(dòng)體溫正負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制,正負(fù)調(diào)節(jié)相互作用的結(jié)果決定調(diào)定點(diǎn)上移水平和發(fā)熱的幅度[5-7]。LPS是一種外源性致熱原,LPS誘導(dǎo)的發(fā)熱是通過(guò)刺激內(nèi)源性致熱源,如IL-1、IL-6等及介導(dǎo)細(xì)胞因子作用于中樞下丘腦視前區(qū)所致[8-9],目前普遍認(rèn)為,PGE2是LPS誘導(dǎo)發(fā)熱的主要中樞遞質(zhì)[10]。本實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到,有LPS誘導(dǎo)的脾虛發(fā)熱模型大鼠體溫升高的同時(shí)伴有下丘腦cAMP和PGE2含量升高,AVP呈下降趨勢(shì),血中相關(guān)細(xì)胞因子未見(jiàn)明顯變化,與LPS誘導(dǎo)正常大鼠發(fā)熱見(jiàn)到的血IL -1β升高[11],下丘腦PGE2/AVP呈升高/下降及cAMP呈降低趨勢(shì)[12]有所不同。結(jié)果表明該模型的發(fā)熱機(jī)制主要涉及到中樞相關(guān)調(diào)質(zhì)的變化,提示LPS致熱機(jī)制可能因機(jī)體不同狀態(tài)而有所不同。

    IL是體內(nèi)活躍的免疫促進(jìn)因子,其水平高低不僅是機(jī)體細(xì)胞免疫的重要標(biāo)志,也是LPS誘導(dǎo)發(fā)熱的重要的內(nèi)源性遞質(zhì)之一[13]。本次由脾虛大鼠注射LPS后,外周血IL-2升高與單純脾虛證模型大鼠的血IL -2降低[14]不同。提示單純脾虛模型和脾虛發(fā)熱模型各自具有不同的免疫狀態(tài)。聯(lián)系到中醫(yī)的理論和經(jīng)驗(yàn),脾虛發(fā)熱的關(guān)鍵病機(jī)是脾虛或氣虛,但臨床上脾虛患者并不必然伴有發(fā)熱,提示脾虛發(fā)熱與單純脾虛有所不同,或可能是脾虛證中的一個(gè)特殊類(lèi)型。目前中醫(yī)有關(guān)脾虛(氣虛)發(fā)熱機(jī)制有各種不同的認(rèn)識(shí)[15],提示同一脾虛發(fā)熱證在內(nèi)涵上存在一定的異質(zhì)性。而本次研究中的脾虛發(fā)熱模型是基于“虛邪致熱”機(jī)制及將LPS作為一種六淫因素的考慮而設(shè)計(jì)的[3],該模型大鼠所伴有中樞-免疫系統(tǒng)變化可能反映了某種脾虛發(fā)熱類(lèi)型的狀態(tài)。

    實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到,各給藥組大鼠體溫均呈不同程度降低,下丘腦PGE2/AVP分別呈降低/升高趨勢(shì),提示其降溫與調(diào)節(jié)中樞體溫正負(fù)調(diào)質(zhì)的含量有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中的大劑量柴胡組和芪柴小劑量組的體溫下降幅度較為明顯,同時(shí)伴有下丘腦IL-1β含量明顯降低,表明此二組的降溫作用還涉及到對(duì)下丘腦IL-1β的下調(diào),提示其退熱作用涉及到中樞的多個(gè)環(huán)節(jié)。

    之前的研究表明大劑量黃芪對(duì)該模型具有明顯的退熱作用[2],本次觀(guān)察到單味大劑柴胡對(duì)該模型也有較好的退熱效應(yīng),而黃芪與小劑量柴胡配伍較之于與大、中劑量配伍的作用更好,表明方藥配伍后的效用不是藥物作用的簡(jiǎn)單相加。柴胡沒(méi)有健脾益氣作用,但對(duì)該模型也有良好的退熱作用,提示中醫(yī)藥-證對(duì)應(yīng)關(guān)系是相對(duì)的。但就對(duì)脾虛發(fā)熱證的整體效應(yīng)評(píng)估來(lái)說(shuō),柴胡是否還對(duì)該證中脾虛相關(guān)指標(biāo)也有改善作用,值得進(jìn)一步研究。

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    (2013-04-22收稿)

    Study on Antipyretic Effects and Mechanism of Astragalus Complying with Different Dosages of Radix Bupleuri

    Zhao Ronghua1,Gao Xiulan2,Xie Ming1,Zhang Jingsheng1
    (1 Formulary Department,the National Key Discipline,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2 Shandong College of Traditional Chinese Medicine,Yantai246100,China)

    Objective:To explore the antipyretic action and mechanism of Astragalus complying with different dosages of Radix Bupleuri on the ratmodels of spleen-qi deficiency with fever.Methods:Themale wistar rats were random ly assigned to the normal group,the spleen-qi deficiency with fever group,the astragaluswith large dosage radix bupleurigroup,the astragaluswithmedium dosage radix bupleuri group,the astragaluswith small dosage radix bupleurigroup,and the radix bupleurigroup.Themodel rats of spleen-qideficiency were prepared through excess fatigue and outof constant diet for21 days.Themedicine group ratswere fed with 4.56g/kg(large),2. 95g/kg(medium)2.41g/kg(small)and 2.41g/kg(radix bupleurionly)once a day and theother two groupswere given physiological saline from the seventeenth day.At8:00 am on the 22th day,the rats ofmodel group and medicine groupswere respectively intraperitonealy injected with lipopoly saccharide(LPS,8 0μg/kg)to induce fever.The rats of the normal group were given physiological saline. The rectal temperature wasmeasured at different time after ip LPS.And then the amounts of cytokines in blood and transmitters which regulate temperature in hypothalamus were also measured.Results:Compared with the normal group,the temperature of rats in the spleen-qi deficiency with fever group raised to some extent at every observation time after ip LPS,especially at60min and 220min(P<0.05).IL-2 in blood、CAMPand PGE2in hypothalamus increased significantly(P<0.05).AVP in hypothalamus had decreased.Compared with the spleen-qi deficiency with fever group,the temperature of rats in everymedicine group decreased significantly to some extent(P<0.05).CAMP and PGE2in hypothalamus increased or decreased(P<0.05).The temperature declined and IL-1βin hypothalamus decreased significantly(P<0.05)in the radix bupleuri group and the astragaluswith small dosage radix bupleuri group.Blood of IL-1βincreased significantly(P<0.05)in the astragaluswith large dosage radix bupleurigroup.Compared with the astragaluswith large dosage radix bupleuri group,blood IL-1βdecreased significantly(P<0.05)in the astragaluswithmedium and with small dosage radix bupleuri groups,aswell as the radix bupleuri group.Blood IL-2 increased significantly(P<0.05)in the astragalus withmedium and with small dosage radix bupleuri groups.Conclusion:Astragalus complying with different dosage of radix bupleuriand only application of large dosage of radix bupleuri had antipyretic effect to themodel ratof spleen-qideficiencywith fever.Its antipyreticmechanism may be connected with reducing central pyrexia amboceptor PGE2and increasing AVP.And astragalus complying with small dosage of radix bup leuri and the only application of large dosage radix bupleurimay be also related to declining of central IL-1β.

    10.3969/j.issn.1673-7202.2013.10.032

    山東省高等學(xué)??萍加?jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):J10LF80)

    謝鳴(1957.6—),男,博士生導(dǎo)師,教授,研究方向:“方證相關(guān)”的研究,E-mail:xieming603@263.net

    Key W ords Astragalusmongholicus;Radix bupleuri;Compatibility;Spleen-qi deficiency with fever;Antipyretic

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