老年和青年豚鼠喉部水通道蛋白1～5表達的研究

李翠娥 陶澤璋 周濤 詹娜 史艷莉

老年和青年豚鼠喉部水通道蛋白1～5表達的研究

李翠娥1陶澤璋1周濤1詹娜2史艷莉3

目的探討青年和老年豚鼠喉部水通道蛋白1～5（aquqporin，AQP1～5）的表達及意義。方法 選取健康4月齡豚鼠（青年組）和2年齡豚鼠（老年組）各10只，用免疫組織化學染色法觀察兩組豚鼠喉部組織AQP1～5的表達，用Image-Pro Plus 6.0 For Window圖像分析軟件處理，比較兩組結(jié)果。結(jié)果 兩組豚鼠喉部組織均有AQP1～5表達，AQP1主要表達在喉黏膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮、固有層的腺體以及小血管內(nèi)皮細胞；AQP2主要表達于黏膜固有層的粘液性腺體和炎性浸潤細胞，黏膜上皮細胞無或弱表達；AQP3高表達于黏膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮，腺體、血管內(nèi)皮細胞和肌纖維組織均無表達；AQP4主要表達于喉黏膜鱗狀上皮、假復(fù)層柱狀纖毛上皮、固有層黏膜腺體、肌纖維及部分浸潤細胞，血管內(nèi)皮細胞無表達；AQP5主要表達于喉黏膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮細胞、上皮基底細胞、黏膜下漿液性腺體及導(dǎo)管，粘液性腺體無表達。青年組喉部AQP1、4的表達高于老年組，AQP5的表達低于老年組（P＜0.05），兩組間AQP2、3的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論 豚鼠喉部組織有AQP1～5表達，老年豚鼠AQP1、4表達降低、AQP5表達升高的變化可能與其喉部老化改變有關(guān)。

豚鼠； 喉； 水通道蛋白； 衰老

自從1992年第一個水通道蛋白（aquqporin，AQP）AQP1的分子特性被報道以來，又發(fā)現(xiàn)了很多其他的AQPs，在人類，至少已發(fā)現(xiàn)了水通道蛋白大家族的13個成員。很多哺乳動物的AQPs，包括AQP1、AQP2、AQP4、AQP5和AQP8，其功能首先是作為雙向選擇性水轉(zhuǎn)運子，與胞膜上無AQPs表達的細胞相比較，胞膜上有AQPs表達細胞的透水性要高5～50倍［1］。AQPs在上皮液體轉(zhuǎn)運和水合作用、神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞遷移、細胞增殖以及脂肪代謝中有重要功能，同時還參與了許多器官（如腦、心、肺等）水腫和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［2，3］。AQP3、AQP7和AQP9還可以轉(zhuǎn)運甘油［4，5］，目前的證據(jù)表明，哺乳動物AQPs的大多數(shù)生物功能都可歸因于AQPs促進水和／或甘油的轉(zhuǎn)運［2］。

AQPs在哺乳動物喉部有不同程度的表達［6～11］，其在喉部表達及調(diào)節(jié)的意義尚未明了。既往研究發(fā)現(xiàn)AQP1在喉癌組織毛細血管內(nèi)皮細胞中的表達較正常組織明顯增多，推測其通過增加喉癌組織上皮和血管對水的通透性，促進腫瘤組織的血管生成，從而促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［12］。目前國內(nèi)尚未見老年豚鼠喉部水通道蛋白表達的研究，因此，本研究擬通過觀察AQP1～5在青年和老年豚鼠喉部的表達，探討其生物學意義及其在喉部衰老中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取健康4月齡豚鼠10只作為對照組（青年組），體重300～550 g，自然衰老的2年齡豚鼠10只作為老年組［13，14］（由四川瀘州醫(yī)學院實驗動物中心提供），體重600～900 g，雌雄不分。

1.2 動物取材及免疫組化染色 本實驗使用的是美國GBI公司推出的兩步法抗兔／鼠通用型免疫組化試劑盒（PV-9000），其試劑一：Polymer Helper（即用型），試劑二：Polyperoxidase-anti-mous／rabbit IgG（即用型），染色步驟按產(chǎn)品說明書操作。

動物用10%的水合氯醛按350 mg／kg劑量腹腔注射麻醉后，斷頭處死，快速取出喉部，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，沿喉的縱軸連續(xù)切片，片厚5μm。石蠟切片65度烤片90分鐘。二甲苯1脫蠟10分鐘，二甲苯2脫蠟10分鐘。梯度酒精依次脫水2分鐘；PBS洗2分鐘二次。檸檬酸緩沖液微波修復(fù)，p H＝6.0。室溫冷卻，PBS洗3次；現(xiàn)配3%H2O2封閉，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS洗3次，甩去PBS液，第一抗體按建議濃度稀釋。每張切片加入50μl稀釋液，4℃過夜。PBS沖洗3次，甩去PBS液，每張切片加50～100μl一抗（試劑一，PV-9000第一抗體），37℃孵育20分鐘。PBS沖洗3次，甩去PBS液，每張切片加50～100μl二抗（試劑二，PV-9000第二抗體），37℃孵育20分鐘。甩去PBS液，每張切片加50～100μl新鮮配制的DAB顯色液，室溫下孵育，顯微鏡控制顯色，顯色完全后，蒸餾水或自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗返藍。切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，光鏡下觀察。以PBS代替一抗做陰性對照。AQP1～5的陽性染色為細胞膜和細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，顏色越深，表達越強。

1.3 統(tǒng)計學方法 圖像用Image-Pro Plus 6.0 For Window（IPP6.0）（Media Cybernetics公司）圖像分析軟件處理，取各圖片的平均值作為灰度值，數(shù)值越大表達越強，兩組間AQP1～5的表達差異顯著性檢驗采用多因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AQP1的表達 AQP1主要在喉黏膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮、固有層的腺體（包括漿液性和粘液性腺體）以及小血管內(nèi)皮細胞中表達，青年組表達強度明顯高于老年組，老年組未見明顯表達（圖1）。

2.2 AQP2的表達 AQP2主要表達于黏膜固有層的粘液性腺體和炎性浸潤細胞，黏膜上皮細胞無或弱表達，青年組和老年組豚鼠喉部AQP2的表達強度無明顯差異（圖2）。

2.3 AQP3的表達 AQP3高表達于喉黏膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮，腺體、血管內(nèi)皮細胞和肌纖維組織均無表達，兩組間AQP3的表達強度無明顯差異（圖3）。

2.4 AQP4的表達 AQP4主要表達于喉黏膜鱗狀上皮、假復(fù)層柱狀纖毛上皮、固有層黏膜腺體、肌纖維及部分浸潤細胞，血管內(nèi)皮細胞無表達，青年組AQP4的表達強度高于老年組，老年組喉部AQP4無表達或弱表達（圖4）。

2.5 AQP5的表達 AQP5主要表達于喉黏膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮細胞、上皮基底細胞、黏膜下漿液性腺體及導(dǎo)管，粘液性腺體無表達，青年組AQP5的表達強度低于老年組（圖5）。

2.6 AQP1～5表達的灰度值比較 兩組豚鼠喉部AQP1～5表達的灰度值見表1，可見青年組AQP1、4的表達高于老年組，AQP5的表達低于老年組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 青年組和老年組喉部AQP1～5表達灰度值比較

3 討論

聲帶的表面液體對維持聲帶黏膜的最佳生物力學性能非常重要，可保持聲帶潤滑、增加聲帶振動的效能，以改善嗓音質(zhì)量［15］，AQPs對喉部腺體的正常分泌有重要作用，腺體的正常分泌不僅對聲帶潤滑非常重要，還通過分泌的免疫球蛋白對黏膜的防疫系統(tǒng)起作用。AQPs可促進快速和高選擇性的水轉(zhuǎn)運，以調(diào)節(jié)細胞體積和滲透梯度［7，11］，故調(diào)節(jié)AQPs可以控制聲帶邊緣的輪廓，改善聲帶的振動，對發(fā)聲生理如發(fā)聲域壓很重要［7］。

圖1 兩組豚鼠聲帶AQP1的表達 （a對照組，b老年組，紅色、藍色箭頭分別表示AQP1在上皮、腺體的表達）（×400）

圖3 兩組豚鼠聲帶AQP3的表達 （a對照組，b老年組）（×400）

圖5 兩組豚鼠聲帶AQP5的表達 （a對照組，b老年組）（×400）

圖2 兩組豚鼠聲帶黏膜下腺體AQP2的表達 （a對照組，b老年組）（×400）

圖4 兩組豚鼠聲帶AQP4的表達 （a～c為青年組，分別為AQP4上皮、腺體和肌纖維中AQP4表達；d～f為老年組，分別為喉的上皮、腺體和肌纖維中AQP4的表達）（×400）

Song等［10］發(fā)現(xiàn)小鼠鼻咽部和上呼吸道黏膜下腺漿液性腺上皮細胞的基底側(cè)膜和內(nèi)膜面有AQP4和AQP5表達，并且證實AQP5對喉部黏膜下腺體的分泌有重要作用。關(guān)兵等［6］發(fā)現(xiàn)，AQP1主要表達于大鼠喉黏膜固有層的血管內(nèi)皮細胞、喉黏膜腺體及肌細胞核膜上，AQP4主要表達于大鼠喉黏膜鱗狀上皮、假復(fù)層柱狀纖毛上皮、固有層黏膜腺體及肌細胞膜上。Lodewyck等［7］用免疫電鏡技術(shù)檢測了AQPs在綿羊喉部的表達，發(fā)現(xiàn)AQP1和AQP2在綿羊聲帶上皮細胞的質(zhì)膜區(qū)有表達，而AQP3在聲帶的表達不能確定，可能與檢測方法有關(guān)。Ahmed等［11］研究發(fā)現(xiàn)，AQP1、4、5在C57BL／6J小鼠喉部上皮包括聲帶有表達，AQP2、3、5、6、7、8表達于喉黏膜下的腺體。不同的AQP在喉部的具體表達部位不同，構(gòu)成了一個水通道蛋白的網(wǎng)絡(luò)，協(xié)同完成對空氣的加濕作用，并精確控制腺體的分泌；同一組織中有多種AQP分布，可以保證細胞便捷地與周圍環(huán)境進行水分的吸收與分泌，從而維持細胞正常的代謝功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，豚鼠喉部有AQP1～5分布，其中AQP3只在上皮表達，AQP2只在腺體表達，AQP1、4、5在上皮和腺體都有表達，AQP1還在小血管內(nèi)皮細胞有表達。AQP1在血管內(nèi)皮細胞中表達，能使水迅速通過毛細血管內(nèi)皮細胞進入胞外組織液中，調(diào)控細胞間的液體量和血管的流體靜壓和膠體膨脹壓，以滿足喉部組織細胞的代謝需要；AQP1、3、4、5在上皮的表達說明其通過經(jīng)上皮的水轉(zhuǎn)運在調(diào)節(jié)聲帶表面的液體平衡中起關(guān)鍵作用［11］；AQP1、2、4、5在腺體的表達有利于腺體分泌?？梢姡聿拷M織中存在多種AQPs表達，可使細胞消耗較少能量進行水分的吸收與分泌，保持喉粘液的正常分泌和黏膜表面濕度，促進纖毛運動，對維持喉部正常生理功能有重要作用。

老年哺乳動物AQPs的表達呈現(xiàn)出年齡相關(guān)性變化。Preisser等［16］發(fā)現(xiàn)在WAG／Rij大鼠腎臟，從10月齡到30月齡，AQP1和AQP4的表達無明顯變化，而AQP2和AQP3的表達分別下降了80%和50%；而Combet［17］卻發(fā)現(xiàn)，老年WAG／Rij大鼠腎臟AQP2表達下調(diào)，AQP3表達卻上升。Zhang等［18］發(fā)現(xiàn)，與8～10周齡小鼠相比較，20～24月齡小鼠肺部AQP1和AQP5的mRNA的表達分別下調(diào)了55.5%和50.3%，AQP1和AQP5蛋白的表達也分別下調(diào)了36.9%和44.6%；Ahmed等［11］也發(fā)現(xiàn)，老年小鼠喉部腺體組織中AQPs的表達下降。從本研究結(jié)果看，與青年組豚鼠比較，老年組豚鼠喉部AQP1、4的表達明顯降低，AQP5的表達明顯增高，說明AQP1、4、5可能參與了豚鼠喉部的老化過程，但其具體機制還需進一步研究。老年豚鼠喉部AQP1、4、5表達的變化可能通過經(jīng)上皮的水轉(zhuǎn)運和黏膜下腺體的分泌影響聲帶表面的液體平衡，進一步影響聲帶黏膜的生物力學性能，從而導(dǎo)致嗓音發(fā)生年齡相關(guān)性改變。本研究觀察到青年組與老年組豚鼠喉部AQP2、3的表達無明顯差異，提示AQP2、3與豚鼠喉部的老化過程可能無關(guān)，但本研究樣本量較少，還有待今后進一步觀察。另外，本研究結(jié)果顯示AQP1～5在喉部的具體表達部位有些與其他研究不同，可能與動物品種和實驗方法不同有關(guān)，但這些均需要進一步研究證實。

（致謝：感謝四川瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科的殷澤登教授對本實驗的幫助與支持?。?/p>

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（2013-03-12收稿）

（本文編輯 雷培香）

The Expression of AQP1～5 in the Larynx of Young and Old Guinea Pig

Li Cuie，Tao Zezhang，Zhou Tao，Zhan Na，Shi Yanli
（Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan，430060，China）

Objective To study the expression of aquaporin（AQP）1～5 in the larynx of young and old guinea pig.Methods Ten young（4 months old）guinea pigs and 10 old（2 years old）guinea pigs were included in this study.The expression of AQP1～5 in the larynx of guinea pigs were detected using immunohistochemistry methods.Results AQP1 was expressed on the pseudo multiple cilium columnar epithelium，glands of the lamina propria and endotheliocyte of the micro vessel under the epidermis.AQP2 was detected on the glands of the lamina propria mucosa，AQP3 was observed on the pseudo multiple cilium columnar epithelium.AQP4 was expressed on the squamous epithelium，the pseudo multiple cilium columnar epithelium，the glands of the lamina propria mucosa and the muscular cells.AQP5 was expressed on the the pseudo multiple cilium columnar epithelium，basal cells，serous glands and pipes.The expression level of AQP1and AQP4 in the young group was higher than that in the old group，while the expression level of the AQP5 was lower（P＜0.05）.The expression level of AQP2 and AQP3 showed no significant difference between the two groups（P＞0.05）.Conclusion AQP1～5 were expressed in the larynx of the guinea pig.AQP1，AQP4 and AQP5 may be associated with the aging of the guinea pig larynx.

Guinea pig； Larynx； Aquaporin；Senium

10.3969／j.issn.1006-7299.2013.04.017

時間：2013-7-3 16：56

R332.2

A

1006-7299（2013）04-0383-04

1 武漢大學人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（武漢 430060）； 2 武漢大學人民醫(yī)院病理科； 3 武漢輕工大學醫(yī)學技術(shù)與護理學院

李翠娥，女，湖北人，主治醫(yī)師，博士，主要研究方向為喉科學及嗓音醫(yī)學。

陶澤璋（Email：taozezhang＠hotmail.com）； 周濤（Email：jasptl＠126.com）

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20130703.1656.009.html