GoldeneyeTM16C系統(tǒng)在批量血樣DNA檢驗(yàn)中的應(yīng)用

劉亞舉，史紹杏，魏鵬飛

（1.許昌市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河南 許昌 461000；2.南陽(yáng)市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河南 南陽(yáng)473000）

法醫(yī)物證檢案中，中速定性濾紙、采集卡以及FTA卡是常用的樣本載體，但因其各有優(yōu)缺點(diǎn)，批量血樣擴(kuò)增步驟繁瑣、成功率不高，本實(shí)驗(yàn)采用GoldeneyeTM16C試劑盒對(duì)這幾種常用載體進(jìn)行直接擴(kuò)增，以提高分型成功率。

1 材料與方法

1.1 樣本

2009年7月—2010年7月本研究所受理案件的建庫(kù)血樣2770份，室溫保存。樣本載體均為紙質(zhì)，包括中速定性濾紙1 200份、公安部物證鑒定中心采集卡800份、長(zhǎng)春博坤公司經(jīng)典型采集卡600份、FTA卡170份。

1.2 主要儀器與試劑

BSD-QP型打孔機(jī)（澳大利亞BSD公司），Hamilton STAR-LET自動(dòng)化工作站（瑞士AusBio公司），PCR擴(kuò)增儀（德國(guó) Eppendorf公司），3500XL型遺傳分析儀、GeneMapper?ID-X分析軟件（美國(guó)AB公司）。GoldeneyeTM16C試劑盒（北京基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

上述血樣用BSD-QP型打孔機(jī)按直徑1.2 mm取樣，檢材置于96孔板管孔內(nèi)。每板中待測(cè)樣本90孔，陰、陽(yáng)性對(duì)照置于F12和G12孔內(nèi)，等位基因標(biāo)準(zhǔn)分型物 Ladder分別置于 H3、H6、H9、H12 孔內(nèi)。

采用GoldeneyeTM16C系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10μL：PCR反應(yīng)緩沖液4μL，引物混合物2μL，Taq聚合酶 0.12 μL，去離子水 3.88 μL。 熱循環(huán)參數(shù)為：95℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，70 ℃ 1 min，29 個(gè)循環(huán)；60 ℃ 60 min。 取 1 μL PCR 產(chǎn)物、0.5 μL ROX500內(nèi)標(biāo)和8.5μL去離子甲酰胺混合，95℃變性3 min后，冰浴3 min，電泳檢測(cè)，用GeneMapper?IDX軟件進(jìn)行等位基因分析。

2 結(jié) 果

經(jīng)GoldeneyeTM16C系統(tǒng)檢驗(yàn)不同載體的DNA血樣，中速定性濾紙和經(jīng)典型采集卡共1800份樣本全部得到完整分型結(jié)果，公安部物證鑒定中心采集卡有46份樣本未得到完整分型結(jié)果，F(xiàn)TA卡全部未得到分型結(jié)果。

將未得到完整分型結(jié)果的46份公安部物證鑒定中心采集卡樣本按2.0 mm直徑取樣，方可獲得完整分型結(jié)果（圖1）。FTA卡1.2mm直徑取樣，經(jīng)純水室溫浸泡2 h，棄上清液，95℃ 5 min后，也獲得滿意分型結(jié)果（圖2）。所獲得的分型結(jié)果峰型均尖銳清晰，并且平衡性好，大部分峰高分布在1000～7000RUF。

圖1 物證鑒定中心采集卡血樣分型圖譜

圖2 FTA卡血樣分型圖譜

3 討 論

目前，全國(guó)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)快速發(fā)展，而實(shí)驗(yàn)室往往需要對(duì)血樣進(jìn)行批量處理。在河南DNA實(shí)驗(yàn)室中，血樣載體主要為中速定性濾紙，其次為公安部物證鑒定中心采集卡和經(jīng)典型采集卡，受價(jià)格因素影響很少用FTA卡。FTA卡血樣不僅含有血紅素、血紅蛋白，而且也有EDTA、Tris和SDS等，水洗血樣后降低了這些抑制因素，從而獲得完整分型。由于公安部物證鑒定中心采集卡紙質(zhì)較厚、滲透能力差、單位面積的細(xì)胞少，所以加大取樣可以提高成功率。在實(shí)際工作中，打孔之前，預(yù)先將96孔板管孔潤(rùn)濕，并將打孔氣閥調(diào)至可以聽到流出氣體的聲音，可以避免由于靜電作用使打孔后的紙片發(fā)生漂移，從而準(zhǔn)確落入到對(duì)應(yīng)的96孔板管孔內(nèi)。中速定性濾紙和經(jīng)典型采集卡血樣檢出成功率較高，一方面是其紙質(zhì)較薄，采集的血液能夠均勻浸透于載體上，屬于雙面血痕，單位血樣中的細(xì)胞含量較多；另一方面是1.2 mm直徑的紙片能牢固固定于96孔板管孔底部，添加擴(kuò)增試劑時(shí)和平板離心機(jī)離心排除氣泡后紙片可始終完全浸沒于PCR反應(yīng)液中，充分保證了模板的擴(kuò)增效果。

在批量血樣的DNA檢驗(yàn)過(guò)程中，建立標(biāo)準(zhǔn)化的檢驗(yàn)程序，選擇適當(dāng)?shù)膬x器設(shè)備，配合簡(jiǎn)潔有效的檢驗(yàn)方法也至關(guān)重要。本研究選擇直接擴(kuò)增程序，以“打孔、擴(kuò)增、電泳”為主線，細(xì)化檢驗(yàn)程序，統(tǒng)籌安排檢驗(yàn)步驟，標(biāo)準(zhǔn)化操作。針對(duì)紙質(zhì)血樣載體直接擴(kuò)增方法，本研究使用了GoldeneyeTM16C系統(tǒng)，該系統(tǒng)是針對(duì)降解、微量檢材和陳舊血樣而設(shè)計(jì)的，擴(kuò)增時(shí)間平均為140min，在擴(kuò)增過(guò)程中能很好地排除抑制物干擾，提高檢測(cè)成功率和峰高均衡性。此外，3500XL型遺傳分析儀對(duì)Ladder和陰、陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置有明確要求，運(yùn)用其ID-X分析軟件既可以對(duì)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)查重又可以檢查檢驗(yàn)過(guò)程中是否有污染，對(duì)所分析的數(shù)據(jù)進(jìn)行復(fù)核，經(jīng)分析復(fù)核無(wú)誤的數(shù)據(jù)即可導(dǎo)入DNA數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)中。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GoldeneyeTM16C系統(tǒng)對(duì)中速定性濾紙和經(jīng)典型采集卡均能獲得較為理想的分型結(jié)果，具有檢驗(yàn)程序簡(jiǎn)單、方法高效簡(jiǎn)潔、成功率高等優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了“打孔、擴(kuò)增、電泳”的簡(jiǎn)化步驟，可以節(jié)省實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)耗材成本、減輕人員勞動(dòng)強(qiáng)度，能夠縮短檢驗(yàn)周期、提高工作效率，滿足基層DNA實(shí)驗(yàn)室建庫(kù)需求，在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中有很好的應(yīng)用前景。