慢性乙醇中毒腦β-淀粉樣前體蛋白與外傷性蛛網(wǎng)膜下腔出血死亡的關(guān)系

魏 來 ，雷懷成 ，于曉軍 ，賴小平 ，錢 紅 ，徐小虎 ，朱方成

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，湖北 十堰 442000；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041；3.廣東醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，廣東 東莞 523808；4.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院病理科，湖南 衡陽 421002）

在法醫(yī)學(xué)檢案實(shí)踐中，常有酗酒者頭頸部遭受輕微外力打擊后發(fā)生外傷性蛛網(wǎng)膜下腔出血（traumatic subarachnoid haemorrhage，TSAH）死亡的案例，經(jīng)系統(tǒng)組織病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)明顯顱腦損傷或腦血管畸形等相關(guān)病變。TSAH造成的死亡一般為酗酒、外傷等多種因素共同參與的結(jié)果，目前尚不完全清楚其發(fā)生及死亡機(jī)制，在死亡原因分析方面往往出現(xiàn)爭議，影響了案件的法醫(yī)鑒定和審判量刑[1-2]。研究[3]顯示，各種腦損傷均可影響β-淀粉樣前體蛋白（beta-amyloid precursor protein，β-APP）表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠慢性灌酒后腦震蕩模型，觀測腦組織神經(jīng)元β-APP的表達(dá)，探討慢性灌酒與腦震蕩致TSAH死亡的相關(guān)機(jī)制，為法醫(yī)病理學(xué)提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

CL級(jí)成年雄性SD大鼠60只 （第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量（300±30）g，隨機(jī)分為灌水組15只、灌水打擊組15只、灌酒組15只、灌酒打擊組15只。

灌酒組和灌酒打擊組：于每天9：00和16：00用食用白酒（52%vol北京紅星二鍋頭）灌胃4周，前2周每次8mL/kg、后2周每次12mL/kg[4-6]；灌水組和灌水打擊組以等量飲用水灌胃，余同樣處置。

1.2 主要試劑與儀器

β-APP多克隆抗體（英國Abcam公司），兔即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒（福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），山羊血清（福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。IM50顯微鏡（德國Leica公司），Image-Pro Plus 6.0病理圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）。

1.3 建立TSAH模型

參照Wang等[6-8]建立腦震蕩模型的方法，最后1次灌胃后2h，將灌水打擊組和灌酒打擊組大鼠固定在自制單擺打擊裝置上，頸下襯墊光滑有機(jī)玻璃枕使頭部上仰45°，擺錘上舉至初始角135°，自由下落，打擊枕外隆凸部。觀察2h，戊巴比妥腹腔注射麻醉后股動(dòng)脈放血處死，立即開胸主動(dòng)脈插管灌注2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液，30min后開顱取全腦。

1.4 染色及圖像處理

全腦旁正中矢狀切取大腦-小腦-腦干，左右側(cè)取額葉、海馬、小腦、腦干組織塊分別常規(guī)石蠟組織切片HE染色、免疫組織化學(xué)染色。SP法：石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2去離子水孵育15 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復(fù)預(yù)處理，滴加山羊血清封閉，滴加一抗稀釋液（1∶100） 60 μL，PBS 替代一抗陰性對(duì)照，4℃冰箱過夜，滴加快捷型酶標(biāo)羊抗兔IgG聚合物滴約 60 μL，37 ℃孵育 20～30 min，PBS 沖洗，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染 3～5min，脫水、透明、封片。

IM50顯微鏡觀察并拍照，β-APP陽性結(jié)果為胞漿黃色至深棕褐色顆粒，顯微鏡400倍視野下選擇5個(gè)視野，Image-Pro Plus 6.0病理圖像分析系統(tǒng)測算累積光密度值（integral optical density，IOD）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用ANOVA方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較各組β-APP IOD值，χ2檢驗(yàn)對(duì)TSAH發(fā)生率及死亡率進(jìn)行比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 一般狀態(tài)

大鼠灌酒后短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)活動(dòng)度增加、興奮性增強(qiáng)、易激惹，之后出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)、運(yùn)動(dòng)遲緩，肌張力降低，側(cè)臥、昏睡、翻正反射消失、對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍等醉酒狀態(tài)，隨著灌酒次數(shù)的增加，逐漸出現(xiàn)毛發(fā)粗糙、無光澤，精神狀況差，體形消瘦，營養(yǎng)不良，進(jìn)食量減少，活動(dòng)減少，肢體癱軟等慢性乙醇中毒改變。灌酒打擊組死亡大鼠在打擊后出現(xiàn)張口呼吸、四肢劇烈抽搐、擺尾后數(shù)分鐘內(nèi)死亡。存活大鼠數(shù)小時(shí)后狀態(tài)好轉(zhuǎn)。

2.2 TSAH發(fā)生率及死亡率

根據(jù)Fisher分級(jí)法[4]，灌酒打擊組大鼠TSAH級(jí)別高于灌水打擊組。灌酒打擊組TSAH發(fā)生率和死亡率分別為80.0%、46.7%，顯著高于灌水打擊組（TSAH發(fā)生率和死亡率分別為13.3%、13.3%，P＜0.05）。

2.3 系統(tǒng)解剖及組織病理學(xué)觀察

灌水組腦表面光滑，神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和分布正常（圖1A）。

灌水打擊組全腦輕度淤血，神經(jīng)細(xì)胞輕度水樣變性（圖 1B）。

灌酒組全腦表面輕度淤血，可見血管紋理，神經(jīng)纖維粗細(xì)不均，排列稍疏松、間隙增大，多見散在暗神經(jīng)元（圖 1C）。

灌酒打擊組腦表面彌漫性淤血，腦干周圍多見厚層斑片狀TSAH，未見明顯腦挫裂傷。大腦神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞彌漫水樣變性，中央尼氏體不同程度消失，周隙擴(kuò)大；多見核固縮、溶解、消失，噬神經(jīng)及衛(wèi)星現(xiàn)象，神經(jīng)元脫失，膠質(zhì)細(xì)胞增生；小腦蒲肯野細(xì)胞明顯減少，染色、疏密不均、核固縮；延髓多見紅色神經(jīng)元及暗神經(jīng)元；神經(jīng)纖維疏松水腫、不規(guī)則增粗、扭曲、斷裂，局部腫脹明顯（圖1D）。

2.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

灌酒組額葉、海馬、小腦、腦干β-APP IOD值顯著高于灌水打擊組；灌酒打擊組額葉、海馬、小腦、腦干β-APP IOD值顯著低于灌酒組（表1）。各組額葉、海馬、小腦、腦干β-APP陽性表達(dá)，可見神經(jīng)元胞漿內(nèi)彌漫細(xì)小顆粒狀或小片狀黃褐色染色，其中灌酒組強(qiáng)陽性表達(dá)，灌水打擊組、灌酒打擊組陽性強(qiáng)度相對(duì)較弱（圖 2～5）。

圖1 大鼠腦干組織病理學(xué)觀察 HE×400

表1 各組大鼠腦組織不同部位β-APP染色I(xiàn)OD值分析 （n=15，±s）

表1 各組大鼠腦組織不同部位β-APP染色I(xiàn)OD值分析 （n=15，±s）

注：1）與相鄰上組比較，P＜0.05

組別 額葉 海馬 小腦 腦干灌水 11.22±1.40 3.09±0.22 4.88±0.71 7.61±1.38灌水打擊 15.18±1.661） 7.97±1.061） 12.58±1.821） 21.01±2.031）灌酒 17.07±2.361） 27.01±4.841） 29.09±3.231） 27.28±2.681）灌酒打擊 14.16±1.531） 12.50±1.631） 13.24±2.231） 20.26±2.501）

圖2 大鼠額葉β-APP蛋白免疫組化染色 SP×400

圖3 大鼠海馬β-APP蛋白免疫組化染色 SP×400

圖4 大鼠小腦β-APP蛋白免疫組化染色 SP×400

圖5 大鼠腦干β-APP蛋白免疫組化染色 SP×400

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)觀察到灌酒大鼠輕微腦震蕩后TSAH發(fā)生率和死亡率分別為80.0%和46.7%，顯著高于灌水打擊組，提示慢性乙醇中毒具有不容忽視的相關(guān)腦血管、凝血和神經(jīng)毒理學(xué)效應(yīng)。

灌酒組腦干等部位神經(jīng)纖維粗細(xì)、疏密不均，多見散在暗神經(jīng)元，表明長期酗酒可引起神經(jīng)元和神經(jīng)纖維組織結(jié)構(gòu)損害。灌酒打擊組軸索不規(guī)則斷裂、扭曲、增粗、周隙擴(kuò)大等腦震蕩性輕微軸索損傷改變，與文獻(xiàn)[6-8]報(bào)道的慢性乙醇中毒引起缺血性神經(jīng)元損傷，白質(zhì)疏松，軸索、膠質(zhì)細(xì)胞缺失，腦萎縮一致。因此，認(rèn)為慢性乙醇神經(jīng)毒理學(xué)改變，與輕微的腦震蕩打擊存在協(xié)同作用，共同參與TSAH高發(fā)生率和高死亡率的病理學(xué)機(jī)制。

β-APP是一種神經(jīng)元快速反應(yīng)性蛋白，具有促進(jìn)快速軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)營養(yǎng)活性、跨膜信號(hào)傳導(dǎo)、穩(wěn)定Ca2+通道等功能。在腦組織機(jī)械性損傷、缺血缺氧、興奮性毒素等因素下，可誘導(dǎo)β-APP增高。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大鼠額葉、海馬、小腦、腦干β-APP的IOD值在灌酒組較灌水打擊組顯著增高，灌酒打擊組較灌酒組顯著降低。提示酗酒的神經(jīng)毒理學(xué)效應(yīng)可增加β-APP表達(dá)，在慢性乙醇毒理作用與外力打擊作用下，代償能力下降，其表達(dá)量顯著降低。β-APP大量表達(dá)，異常裂解產(chǎn)生Aβ，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)，破壞Ca2+穩(wěn)態(tài)，增加興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)毒性，并通過去甲腎上腺素及其他內(nèi)源性活性物質(zhì)增加血管收縮性，導(dǎo)致神經(jīng)元缺血性損傷，同時(shí)，氧自由基產(chǎn)物增加，損傷細(xì)胞膜、細(xì)胞器和細(xì)胞骨架，促神經(jīng)細(xì)胞凋亡；其亦可促使Tau蛋白過磷酸化，破壞微管，導(dǎo)致神經(jīng)元胞體和軸索之間運(yùn)輸障礙，神經(jīng)纖維末端突觸退行性變，形成神經(jīng)纖維纏結(jié)等[9-12]。在慢性乙醇毒理作用與外力打擊作用下，降低了β-APP維持Ca2+通道穩(wěn)定、信號(hào)傳導(dǎo)、營養(yǎng)等生理功能。因此，認(rèn)為酗酒引發(fā)的β-APP過表達(dá)及其異常裂解產(chǎn)生Aβ，可能是參與灌酒和腦震蕩打擊致TSAH死亡的機(jī)制之一。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)長期酗酒引發(fā)腦組織β-APP過量表達(dá)，與其他乙醇中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒理學(xué)慢性累積作用一起，協(xié)同腦震蕩性損傷，發(fā)生急性大面積蛛網(wǎng)膜下腔出血，顱內(nèi)壓增高、腦水腫、組織結(jié)構(gòu)損害，最終致中樞神經(jīng)功能障礙。乙醇及其代謝產(chǎn)物的毒理作用除中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，還涉及全身多個(gè)器官系統(tǒng)，慢性酗酒的毒理學(xué)作用導(dǎo)致TSAH高發(fā)生率和死亡率應(yīng)是多方面因素共同作用的結(jié)果[13]，有待進(jìn)一步研究。

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