HPLC ELSD同時分離檢測食品中十種單糖、雙糖和低聚果糖

李 燦，陳 英，李 培，錢 和，姚衛(wèi)蓉，*

(1.蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇蘇州215140;2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122)

糖類一般指多羥基醛、多羥基酮或水解后產(chǎn)生這些化合物的一大類有機(jī)化合物［1］，它是生命過程中的主要能量來源［2］。糖類在食品中影響食品質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、穩(wěn)定性、甜味等性質(zhì)，同時也是食品中的主要營養(yǎng)素。食品中糖類的種類及含量的多寡直接影響到食品的質(zhì)量與營養(yǎng)價值［3］。隨著人們生活水平的提高，食品工業(yè)的發(fā)展，人們的膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生了急劇變化，引發(fā)了各種“吃糖”過多所導(dǎo)致的健康問題，如齲齒、肥胖、高血脂、高血壓、糖尿病、冠心病等。目前國內(nèi)對食品中糖含量檢測應(yīng)用和研究較多的方法主要包括化學(xué)檢測法［4-5］、高效液相色譜-熒光散射檢測法［6］、高效液相色譜-示差折光檢測法［7-9］、離子色譜法［10］等。但是化學(xué)法耗時較長，只能測定總糖和還原糖的含量，無法進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析;高效液相色譜-熒光散射法由于需要目的物具有熒光特性，用于糖的檢測時需要對其進(jìn)行衍生化處理，降低了其通用性;目前國標(biāo)GB/T 22221-2008和GB/T 22222-2008中測定單糖、雙糖和糖醇含量采用了高效液相色譜-示差折光法，該法靈敏度較低，且無法進(jìn)行梯度洗脫，使得其難以用于多種糖的同時分離檢測;離子色譜法在糖含量的檢測研究中較多，其靈敏度較好，但是糖類在電極表面能將某些分子氧化或還原，從而影響方法的準(zhǔn)確性，并且受環(huán)境溫度的影響。目前尚未見到采用HPLC-ELSD法對十種糖進(jìn)行同時分離檢測的相關(guān)報道。針對食品中常見的十種單糖、雙糖、低聚果糖，包括木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖，本論文主要擬采用NH2柱進(jìn)行梯度洗脫分離，并結(jié)合新一代的質(zhì)量型通用檢測器-蒸發(fā)光散射檢測器(Evaporative light-scattering detector，ELSD)進(jìn)行檢測，從而建立高效、準(zhǔn)確、快速、靈敏的多種糖類同時分離檢測的技術(shù)，為糖類的檢測、應(yīng)用和監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6種嬰兒配方奶粉、洋槐蜜、蜂蜜、果粒橙、紅葡萄汁、乳飲料、番茄汁、芒果果露、月餅、口紅棒，牛奶扎糖共16種樣品，均來源于蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所抽檢樣品;木糖(純度97.9%)、半乳糖(純度99.5%)、果糖(純度 99.5%)、葡萄糖(純度98%)、蔗糖(純度 95%)、麥芽糖(純度 92%)、乳糖(純度99%)標(biāo)準(zhǔn)品 Dr Ehrenstorfer GmbH，德國;低聚果糖(蔗果三糖99.0%、蔗果四糖99.0%、蔗果五糖80.0%，HPLC級)和光純藥工業(yè)株式會社;石油醚(沸程30～60℃，分析純)天津市大茂化學(xué)試劑廠;亞鐵氰化鉀(99.5%，分析純)上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;乙酸鋅(99.0%，分析純)天津市大茂化學(xué)試劑廠;三氯乙酸(分析純)國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈(99.9%，色譜純)TEDIA公司。

Agilent 1200series高效液相色譜儀、Agilent ZORBAX NH2柱(5μm，4.6×250mm)安捷倫科技有限公司;Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測器 美國格瑞斯公司;KQ2200超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;XS204電子天平 瑞士梅特勒-托利多;水相針式濾器(聚醚砜，0.22μm)上海安譜科學(xué)儀器有限公司;Millipore去離子水器 蘇州賽恩斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 15%三氯乙酸溶液 稱取15g三氯乙酸于150mL燒杯中，用100mL超純水溶解，轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶，并每月更換。

1.2.1.2 亞鐵氰化鉀溶液 稱取10.6g亞鐵氰化鉀于150mL燒杯中，取100mL超純水溶解，后轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中待用，并每月更換。

1.2.1.3 乙酸鋅溶液 稱取乙酸鋅21.9g，加入3mL冰乙酸，加超純水定容到100mL，并轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中備用，并每月更換。

1.2.1.4 單糖、雙糖、低聚果糖單標(biāo)儲備液的配制分別準(zhǔn)確稱取木糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖各0.25g(精確到0.1mg)于150mL燒杯中，用10mL超純水溶解，超聲波振蕩2min，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，并用超純水定容至刻度，4℃冰箱保存。

1.2.1.5 單糖、雙糖、低聚果糖混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 分別取配制好的各單標(biāo)液2mL于25mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配成各糖濃度均為0.8mg/mL的混標(biāo)液，4℃冰箱保存，待液相檢測。

1.2.2 樣品的前處理［8-9］

1.2.2.1 乳飲料 稱取乳飲料1～5g(M1，精確到0.1mg)，緩慢加入15%三氯乙酸0.5～3mL，加超純水定量至 100g(M2，精確到 0.1mg)，40℃水浴 30min，用干燥濾紙過濾，取少量濾液過0.22μm水相濾膜至樣品瓶中，待液相檢測。

1.2.2.2 配方奶粉 稱取奶粉2g(M1，精確到0.1mg)于50mL具塞離心管中，加入45mL石油醚(沸程30～60℃)，振蕩 2min后 8000r/min 離心 5min，棄去石油醚，重復(fù)以上操作至去除大部分脂肪，棄去石油醚，氮吹揮干殘留石油醚后轉(zhuǎn)移至150mL燒杯中，用20mL超純水分兩次清洗離心管，并將清洗液轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液各3.5mL，加超純水定量至50g(M2，精確到0.1mg)，40℃水浴30min，用干燥濾紙過濾，取少量濾液過0.22μm水相濾膜至樣品瓶中，待液相檢測。

1.2.2.3 蜂蜜、果蔬汁飲料 稱取蜂蜜、果蔬汁飲料1～50g(M1，精確到0.1mg)于150mL燒杯中，加超純水定量至 100g(M2，精確到 0.1mg)，超聲波振蕩5min，用干燥濾紙過濾，取少量濾液過0.22μm水相濾膜至樣品瓶中，待液相檢測。

1.2.2.4 月餅 稱取粉碎處理后的月餅2g(M1，精確到0.1mg)于50mL具塞離心管中，加入45mL石油醚(沸程30～60℃)，振蕩2min，8000r/min 離心5min，棄去石油醚，重復(fù)以上操作至去掉大部分脂肪，揮干(氮吹)殘余石油醚，將月餅轉(zhuǎn)入150mL燒杯中，加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液各3～5mL，用超純水定量至100g(M2，精確到0.1mg)，超聲波振蕩30min，干燥濾紙過濾，取少量濾液過0.22μm水相濾膜至樣品瓶中，待液相檢測。

1.2.2.5 糖果(如口紅棒、牛奶扎糖)稱取粉碎的硬質(zhì)糖果1g(M1，精確到0.1mg)至150mL燒杯中，加超純水定量到100g(M2，精確到0.1mg)，超聲波振蕩5min，干燥濾紙過濾，取少量濾液過0.22μm水相濾膜至樣品瓶中，待液相檢測。

1.2.3 液相檢測條件

1.2.3.1 高效液相色譜分離條件 色譜柱:Agilent ZORBAX NH2柱(5μm，4.6 ×250mm);柱溫 30℃;流動相:A:乙腈，B:水;梯度洗脫程序見表1，流動相流速 1mL/min，進(jìn)樣量10μL。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的梯度洗脫程序Table 1 The elution gratitude program of standard mixed solution

1.2.3.2 蒸發(fā)光散射檢測器檢測條件 漂移管溫度為60℃，載氣為氮氣，載氣流速為1.2L/min，增益為1。

1.2.4 糖含量的計算 將色譜圖中各糖的保留面積代入該糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算該糖在樣液中的濃度C(mg/g)。

式中:X為樣品中糖含量(%)，C為樣品提取液中糖的含量(mg/g)，M1為樣品質(zhì)量(g)，M2為定量質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC－ELSD分離檢測

2.1.1 液相條件的選擇 糖類檢測較常用的柱子有NH2柱，鈣型陽離子柱，由于對多種糖標(biāo)液進(jìn)行同時分離時，依據(jù)不同糖分子與NH2柱形成氫鍵結(jié)合力的強(qiáng)弱不同，在分離時更具有優(yōu)勢，因此，選擇了NH2柱，同時流動相選擇乙腈-水。通過改變乙腈-水的比例(見圖1)，發(fā)現(xiàn)各種糖的保留時間會發(fā)生顯著變化，并且隨著水的比例的增加而保留時間不斷縮短，當(dāng)以乙腈水為75∶25(條件A)等度洗脫時，發(fā)現(xiàn)10種物質(zhì)保留時間較相近，其中果糖、葡萄糖、半乳糖三者保留時間接近，無法完全分離，這可能與三者相近的分子結(jié)構(gòu)以及形成氫鍵的能力有關(guān);當(dāng)乙腈水比例分別以80∶20和75∶25的等度洗脫時(條件B)，可以發(fā)現(xiàn)10種物質(zhì)的保留時間增大，但這三種物質(zhì)仍無法分離;當(dāng)乙腈水比例從80∶20漸變到87∶13，再從 87∶13 漸變到 75∶25 并保持時(條件C)，發(fā)現(xiàn)分離效果變佳，但葡萄糖和半乳糖這兩種同分異構(gòu)體仍無法分離;條件D時的分離效果則不如條件C。通過對四種梯度洗脫條件進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加大水的比例時，各物質(zhì)的保留時間增大，保留時間相近物質(zhì)的分離度增大，但是葡萄糖和半乳糖由于屬于同分異構(gòu)體，分子內(nèi)含羥基數(shù)目相同，仍不能較好分離，但可以發(fā)現(xiàn)葡萄糖的保留時間比半乳糖稍小，可以通過嘗試在兩者被洗脫時間之前增大乙腈比例，將兩者被洗脫時間延長從而實現(xiàn)兩者的完全分離，并在洗脫后期增加水的比例從而加快低聚果糖的洗脫，縮短整體的分離時間。最后在條件C的基礎(chǔ)上對流動相比例隨時間變化進(jìn)行細(xì)微調(diào)整后，終于可實現(xiàn)以上10種糖的較好分離，此時混合標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度洗脫順序如表1所示。

2.1.2 蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)條件的優(yōu)化ELSD的兩個較重要的參數(shù)分別是漂移管溫度和載氣流速，兩者對組分的保留時間影響較小，但是對信噪比(S/N)影響較大，一般建立適當(dāng)?shù)腍PLC-ELSD分析方法時，必須對這兩個參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。其中漂移管溫度對基線與噪音的影響并沒有明顯的規(guī)律，優(yōu)化的原則一般是選擇在達(dá)到最佳信噪比時的最低漂移管溫度，因為漂移管溫度越高，流動相趨向沸騰，會逐漸降低信噪比;最佳的載氣流速是在可接受的噪音的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生最高檢測響應(yīng)值的最低流速;綜合以上考慮，經(jīng)過摸索(見圖2)，確定最佳漂移管溫度為60℃，最佳載氣流速為1.2L/min。

圖1 四種不同梯度條件下得到的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution with four different elution gratitude

圖2 不同漂移管溫度和不同載氣流速時混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed standard solution in different drift temperature and different carrier gas flow rate

最終確定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分離的最佳條件如1.2.3所示，此時混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖3所示。

表3 十種糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限Table 3 Standard curve equation，linear range，linear correlation coefficient，detection limit of ten sugars

表4 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC-ELSD分離檢測的精密度實驗Table 4 Precision test of HPLC-ELSD separation and detection of mixed standard solution

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC-ELSD分離色譜圖Fig.3 HPLC-ELSD separation chromatogram of mixed standard solution

2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)及檢出限

將10mg/mL的各種糖標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋為5、3、2、1、0.5、0.1、0.05mg/mL 的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，在 1.2.3的液相檢測條件下檢測，根據(jù)各糖梯度溶液的峰面積(Y)對濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得到十種糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表3。依次將糖標(biāo)液濃度不斷稀釋至譜圖中信噪比為3時，此時濃度為該糖的檢出限，結(jié)果見表3。

2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC－ELSD檢測的精密度實驗

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在1.2.3的液相檢測條件下進(jìn)樣6次，根據(jù)各組分的峰面積變化確定液相分離檢測的精密度［11］，結(jié)果表明十種糖的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在1.71%～7.21%之間，表明該法的精密度較高，結(jié)果見表4。

2.4 方法的加標(biāo)回收率考察

選擇3種樣品，分別加入1.2.1.4中配好的不同體積的各種單標(biāo)液，進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗，在1.2.3的分離檢測條件下，測得各組分的平均回收率均在97.91%～103.35%之間(表5)。結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度較高，可以用于實際樣品的檢測。

續(xù)表

2.5 實際樣品分析

采用本研究中建立的方法，對16種實際樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表6，部分樣品分析色譜圖見圖4。

3 結(jié)論

本研究建立了對食品中木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等十種糖同時分離檢測的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法。研究結(jié)果表明，該檢測方法具有較寬的線性范圍，精密度和準(zhǔn)確度良好，將其用于食品中以上10種糖的測定時，具有較好的通用性;本法能為糖類食品生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制和質(zhì)檢部門的市場監(jiān)督提供科學(xué)依據(jù)，同時也能作為單糖、雙糖、低聚果糖同時分離檢測國家標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)。

圖4 部分實際樣品分析色譜圖Fig.4 Analysis chromatogram of part real samples

表6 16種食品中糖含量的檢測結(jié)果(mg/g)Table 6 Detection results of sugar contents in 16 kinds of food

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