木瓜蛋白酶酶解小桐子仁粕制備小肽的研究

賈文倩，王舒怡，龔寬俊，李寶才，張惠芬，角仕云，秦 誼，*

（1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500；2.昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南昆明650500）

小桐子（Jatropha curcas L.）為大戟科麻瘋樹(shù)屬植物，是一種耐瘠抗旱的速生、多用途油料植物。因其種仁大，含油率高，被認(rèn)為是發(fā)展生物柴油的最適宜樹(shù)種[1]。2006年，國(guó)家林業(yè)局將小桐子作為林業(yè)生物質(zhì)能源研發(fā)首選樹(shù)種，主要用于生物能源的開(kāi)發(fā)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)目前人工種植的小桐子林木多達(dá)200萬(wàn)公頃，預(yù)計(jì)年產(chǎn)生物柴油500萬(wàn)t[2]。小桐子仁粕是小桐子種仁制備生物柴油后的副產(chǎn)品，完全脫脂的小桐子仁粕含40%～60%的粗蛋白，其中90%為真蛋白，且氨基酸組成平衡，是生產(chǎn)動(dòng)物蛋白質(zhì)飼料的優(yōu)質(zhì)原料[3-5]。由于含有植物凝集素、胰蛋白酶抑制劑、佛波醇酯等抗?fàn)I養(yǎng)因子和毒素，小桐子仁粕不能被直接用作動(dòng)物飼料，但隨著脫毒技術(shù)的不斷進(jìn)步，目前小桐子仁粕中的大部分毒素已經(jīng)可以被有效脫除[4，6-8]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，蛋白質(zhì)在動(dòng)物消化酶作用下的水解終產(chǎn)物大部分是由2個(gè)或3個(gè)氨基酸殘基組成的小肽，它們能完整地通過(guò)腸粘膜細(xì)胞進(jìn)入體循環(huán)。同游離氨基酸相比，小肽的吸收具有轉(zhuǎn)運(yùn)速度快、耗能低、載體不易飽和等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)它還可以促進(jìn)機(jī)體對(duì)游離氨基酸及礦物質(zhì)元素的吸收，提高蛋白質(zhì)沉積率，因此，含有大量小肽的小肽飼料比傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)飼料具有更優(yōu)越的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9-10]。本研究應(yīng)用木瓜蛋白酶水解小桐子仁粕蛋白質(zhì)，產(chǎn)生小肽，以改善小桐子仁粕的營(yíng)養(yǎng)性能。酶解產(chǎn)物可以直接作為小肽飼料飼養(yǎng)動(dòng)物，也可以作為生產(chǎn)小肽飼料的原料或添加劑，提高動(dòng)物對(duì)小桐子仁粕蛋白質(zhì)的吸收利用率。該工藝綠色環(huán)保，操作簡(jiǎn)單且成本較低，可以直接生產(chǎn)出小肽飼料，具有大規(guī)模投入生產(chǎn)的潛力。以小桐子仁粕固體原料作為底物，直接進(jìn)行酶解制備小肽的研究尚屬首次報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小桐子種子 采自云南元江哈尼族彝族傣族自治縣；木瓜蛋白酶 購(gòu)自Sigma公司，4000U/mg；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)室用水 為蒸餾水。

FD-1A-50型冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器有限公司；PHS-2C型精密酸度計(jì) 上海虹益儀器儀表有限公司；T2000Y型電子天平 美國(guó)雙杰兄弟有限公司；HH-S6型多功能電子恒溫水浴鍋 江蘇省醫(yī)療器械廠；HGT-2型干式恒溫器 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；HG101-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；DL-5-B型低速大容量多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小桐子仁粕的制備與脫毒 參照文獻(xiàn)[8，11]中的方法制備小桐子仁粕，同時(shí)進(jìn)行脫毒。小桐子種子去殼取仁，粉碎后過(guò)80目篩，置于索氏提取器中用石油醚（60～90℃）進(jìn)行脫脂；完全脫脂后，仁粕在室溫下用90%乙醇浸提2h，料液比為1∶10。脫毒后的小桐子仁粕60℃真空干燥，測(cè)定水分、總蛋白質(zhì)和小肽含量。

1.2.2 小桐子仁粕的酶解 稱取小桐子仁粕，與適量的水、木瓜蛋白酶混勻，調(diào)節(jié)pH，放入設(shè)定溫度的恒溫箱中酶解，一段時(shí)間后取出，置于沸水浴中加熱10min終止酶解反應(yīng)。酶解產(chǎn)物60℃真空干燥后，測(cè)定水分、總蛋白質(zhì)和小肽含量。

1.2.3 酶解工藝的優(yōu)化 料液比、酶解溫度、pH、加酶量和酶解時(shí)間為影響蛋白質(zhì)酶解的主要因素。以酶解產(chǎn)物中小肽含量為指標(biāo)，先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察各因素對(duì)木瓜蛋白酶酶解小桐子仁粕的影響，確定各因素取值范圍，在此基礎(chǔ)上用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終確定木瓜蛋白酶酶解小桐子仁粕制備小肽的最佳工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)因素和水平的取值由單因素實(shí)驗(yàn)確定，具體見(jiàn)表1。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and 1evels of the L9（34）test

1.2.4 樣品分析方法 小肽含量的測(cè)定（TCA法）參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2879-2007：樣品經(jīng)三氯乙酸溶液溶解后，離心分離出沉淀物質(zhì)，清液中的酸溶蛋白質(zhì)含量減去游離氨基酸含量即為小肽含量[12]?？偟鞍踪|(zhì)和水分分別按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6432-1994和GB/T 6435-1986測(cè)定[13-14]。樣品中小肽含量占總蛋白質(zhì)含量的比重為小肽百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比的選擇

在加酶量120U/g、pH6、溫度50℃、酶解24h的條件下，考察料液比對(duì)小桐子仁粕酶解產(chǎn)物小肽含量的影響，結(jié)果如圖1所示。開(kāi)始時(shí)酶解產(chǎn)物中的小肽含量隨料液比的減小而升高，當(dāng)料液比為1∶3g/mL時(shí)，小肽含量最高，料液比繼續(xù)減小時(shí)小肽含量下降，這可能是酶解產(chǎn)物中游離氨基酸增多所致。因此，最適料液比在1∶3g/mL左右。在此料液比條件時(shí)，小桐子仁粕酶解液為勻漿狀混合物，既可以直接作為小肽飼料飼養(yǎng)動(dòng)物，也可以干燥后作為飼料原料或添加劑使用。

圖1 料液比對(duì)小肽含量的影響Fig.1 Influence of solid-liquid ratio on the content of small peptides

2.2 酶解溫度的選擇

在加酶量120U/g、料液比1∶3g/mL、pH6、酶解24h的條件下，考察酶解溫度對(duì)小桐子仁粕酶解產(chǎn)物小肽含量的影響，結(jié)果如圖2所示。開(kāi)始時(shí)酶解產(chǎn)物中的小肽含量隨溫度的升高而升高，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，含量最高，之后溫度繼續(xù)上升，小肽含量反而呈下降趨勢(shì)，這可能是酶活性在較高溫度時(shí)受到抑制的緣故。因此，選擇最適酶解溫度在50℃左右。

圖2 酶解溫度對(duì)小肽含量的影響Fig.2 Influence of enzymolysis temperature on the content of small peptides

2.3 pH的選擇

在加酶量120U/g、料液比1∶3g/mL、溫度50℃、酶解24h的條件下，考察體系pH對(duì)小桐子仁粕酶解產(chǎn)物小肽含量的影響，結(jié)果如圖3所示。木瓜蛋白酶酶解小桐子仁粕最適pH在5.0～5.5，pH為5.0時(shí)小肽含量最高，這也是木瓜蛋白酶的最適使用pH范圍，酶解過(guò)程中pH過(guò)高或過(guò)低均會(huì)降低酶活性。

圖3 pH對(duì)小肽含量的影響Fig.3 Influence of pH on the content of small peptides

2.4 加酶量的確定

在料液比1∶3g/mL、pH5、溫度50℃、酶解24h的條件下，考察加酶量對(duì)小桐子仁粕酶解產(chǎn)物小肽含量的影響，結(jié)果如圖4所示。小肽含量隨著加酶量的增大而升高；在加酶量小于180U/g時(shí)，隨著加酶量增加小肽含量顯著提高；但當(dāng)加酶量大于180U/g時(shí)小肽含量增加不明顯，甚至出現(xiàn)下降。理論上，加酶量越高，底物與酶分子的接觸機(jī)率就越高，反應(yīng)越容易進(jìn)行。但TCA法測(cè)定小肽的原理是樣品中酸溶蛋白質(zhì)含量減去游離氨基酸含量即為小肽含量，加酶量過(guò)多不僅增加成本，而且可能使蛋白質(zhì)過(guò)度水解產(chǎn)生更多游離氨基酸，最終導(dǎo)致小肽含量減少。因此，選擇加酶量在180U/g左右較合理。

圖4 加酶量對(duì)小肽含量的影響Fig.4 Influence of enzyme amount on the content of small peptides

2.5 酶解時(shí)間的選擇

在加酶量180U/g、料液比1∶3g/mL、pH5、溫度50℃的條件下，考察酶解時(shí)間對(duì)小桐子仁粕酶解產(chǎn)物小肽含量的影響，結(jié)果如圖5所示。開(kāi)始時(shí)酶解產(chǎn)物中的小肽含量隨酶解時(shí)間的增加而明顯升高，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到36h后，小肽含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是過(guò)度酶解使產(chǎn)物中游離氨基酸增多所致。同時(shí)考慮到生產(chǎn)效率，酶解時(shí)間在36h左右較合適。

2.6 酶解工藝的優(yōu)化

綜合分析單因素實(shí)驗(yàn)，確定加酶量為180U/g，選取對(duì)酶解產(chǎn)物中小肽含量影響較大的四個(gè)因素（酶解時(shí)間、料液比、pH、酶解溫度）進(jìn)一步通過(guò)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。通過(guò)極差分析可以看出，影響小桐子仁粕酶解產(chǎn)物小肽含量的各因素主次順序?yàn)椋篈＞C＞D＞B，最佳酶解工藝為A2B2C3D2，即：酶解時(shí)間36h，料液比1∶3，pH5.5，酶解溫度50℃。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)小肽含量的影響Fig.5 Influence of enzymolysis time on the content of small peptides

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

2.7 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在確定的最佳工藝條件下進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，所得酶解產(chǎn)物的小肽含量分別為218.28、213.06、220.91mg/g，平均值為217.42mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.84%。

2.8 樣品分析

表3 樣品分析結(jié)果Table 3 The results of sample analysis

小桐子仁粕原料和最佳工藝條件下酶解產(chǎn)物的水分、粗蛋白和小肽的含量如表3所示。本研究的目的是酶解小桐子仁粕中的蛋白質(zhì)生產(chǎn)小肽，因此并非蛋白質(zhì)水解度越高越好，理想的效果是水解度較高，同時(shí)酶解產(chǎn)物中小肽的比重高，而游離氨基酸的比重低。在本實(shí)驗(yàn)的最佳酶解條件下，可以使底物中小肽占總蛋白質(zhì)的比重從7.11%升高至39.68%。

3 結(jié)論

木瓜蛋白酶是一種高效蛋白水解酶，用于酶解小桐子仁粕可以獲得較高產(chǎn)量的酶解產(chǎn)物——小肽。通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)，得到最佳酶解工藝條件為：加酶量180U/g，酶解時(shí)間36h，料液比1∶3，pH5.5，酶解溫度50℃，在此條件下酶解產(chǎn)物中的小肽含量可達(dá)217.42mg/g。同時(shí)，木瓜蛋白酶還具有酯酶的活性，對(duì)動(dòng)植物中的酯、酰胺等也有較強(qiáng)的水解能力，這對(duì)促進(jìn)小桐子仁粕中主要毒素佛波醇酯的水解，減少水解產(chǎn)物中殘留毒性物質(zhì)具有積極作用[15-16]。該工藝綠色環(huán)保，操作簡(jiǎn)單且成本較低，可以利用小桐子仁粕直接生產(chǎn)出小肽飼料，提高蛋白質(zhì)的利用效率，這對(duì)于小桐子資源的綜合利用以及緩解我國(guó)蛋白質(zhì)飼料短缺具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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