碎米雙酶解成注射用葡萄糖的液化糖化工藝研究

劉文龍，賀福元，楊巖濤，石繼連，3，鄒 歡，唐 昱，邱 云，黃 勝，陳 鋒

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208；2.湖南師范大學(xué)生科院，湖南長(zhǎng)沙410081；3.中藥藥性與藥效國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410208）

近年來(lái)，隨著醫(yī)療技術(shù)的迅速發(fā)展，臨床上葡糖糖注射液的需求量在迅速增長(zhǎng)。作為臨床上最常用的一種治療藥物，注射用葡糖糖目前正處在供不應(yīng)求的狀態(tài)[1]。目前注射用葡萄糖主要由玉米采用NOVO酶法制備而成，由于玉米不是我國(guó)農(nóng)作物的主打產(chǎn)品，且以玉米為原料生產(chǎn)供應(yīng)周期長(zhǎng)，費(fèi)用高等特點(diǎn)給我國(guó)的注射用葡萄糖的供給帶來(lái)諸多不便[2]。因此，尋求注射用葡萄糖新原料、研發(fā)新品種凸顯重要性。稻米是世界眾多國(guó)家的農(nóng)作物，而我國(guó)又是世界上大米生產(chǎn)與消費(fèi)最大的國(guó)家，每年生產(chǎn)約1.89億t的稻谷（合1.4億t稻米）。由于袁隆平院士雜交水稻的誕生，使得稻米的生產(chǎn)量供過(guò)于求，在一定程度上造成了稻谷的囤積和勞動(dòng)力的過(guò)剩。為此，許多專家曾以大米為原料研發(fā)注射用葡萄糖，但由于其生產(chǎn)成本高于以玉米為原料等原因而停滯不前[3-4]。限于現(xiàn)有的碾米技術(shù)，在稻谷碾制過(guò)程中，不可避免產(chǎn)生10%左右的碎米，這些碎米主要被廉價(jià)處理于燃料或飼料加工原料等領(lǐng)域。如能將碎米原料研發(fā)成注射用葡萄糖新藥，那將大大地提升其附加值，對(duì)于促進(jìn)我省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，提高農(nóng)民收入，推動(dòng)我國(guó)稻米加工產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，具有重要的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)意義[5-8]。因此，本文先從其液化糖化工藝展開(kāi)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

色譜純乙腈 美國(guó)Tedia公司；耐高溫α-淀粉酶諾維信生物科技公司（149U/mL，編碼001）、常德津市新型發(fā)酵廠（20000U/mL，編碼002）、常德鴻鷹祥公司（20000U/mL，編碼003）；糖化酶 杰能科生物科技公司（100000U/mL，編碼004）、常德津市新型發(fā)酵廠（50000U/g，編碼005）、常德鴻鷹祥（50000U/g，編碼006）；普魯蘭酶 杰能科生物科技公司（100000U/g）；D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（110833-200503） 中國(guó)生物制品檢驗(yàn)所；所用試劑 均為分析純；所有試劑 均用不含氨的蒸餾水配制，所用的碎米都是經(jīng)過(guò)質(zhì)量篩選（農(nóng)殘、黃曲霉毒素）的合格樣品；混合指示液 1份0.1%甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時(shí)混合。

阿貝折射儀 上海成光儀器公司；HH-數(shù)顯恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器公司；FW135萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器公司；LE438 pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器公司；SK3300H超聲儀 上?？茖?dǎo)；AR1140/C電子天平 奧豪斯有限公司；超純水制備儀 摩爾公司；HH-數(shù)顯恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器公司；Waters 1525 HPLC儀，Waters 2410示差折光檢測(cè)器，Waters Breeze工作站，月旭Ultimate XBNH2柱（250mm×4.5mm，2.5μm）；

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 碎米預(yù)處理工藝研究

1.2.1.1 碎米原料的前處理 將碎米原料用凈水充分水洗，除去懸浮物、可溶性灰分及異物，浸泡2～3h除去一些水溶性蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。

1.2.1.2 碎米原料的淀粉測(cè)定 根據(jù)GB/T 5009.9-2003酸水解法和GB/T 5009.7-2008還原糖測(cè)定的直接滴定法進(jìn)行測(cè)定的。

1.2.1.3 碎米原料蛋白質(zhì)含量測(cè)定 依據(jù)凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.1.4 碎米原料的磨漿工藝研究 磨漿關(guān)鍵在于掌握細(xì)度和濃度，過(guò)細(xì)則堆密度降低，致使碎米濃度不夠，過(guò)粗則液化困難。因此考察細(xì)度及浸泡時(shí)間，進(jìn)行兩因素完全隨機(jī)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)磨漿工藝的主要目的是如何更有效地去除其蛋白質(zhì)雜質(zhì)成分，而選用蛋白質(zhì)的百分含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。細(xì)度按20、40、60、80、100目五水平考察，浸泡時(shí)間按3、4、6h三水平考察，根據(jù)完全隨機(jī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)15次實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 液化工藝研究 碎米酶解液化工藝過(guò)程主要是碎米淀粉糊化的過(guò)程，主要生成低聚糖等糖類分子，液化工藝好壞直接影響到后續(xù)的糖化工藝，優(yōu)化其工藝參數(shù)尤為重要，有參考文獻(xiàn)對(duì)粉碎度、酶用量、液化時(shí)間、pH、溫度等因素對(duì)液化工藝的影響進(jìn)行了考察[9-10]。本文先以DE值（還原糖含量）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)耐高溫淀粉酶用量進(jìn)行單因素考察，并對(duì)液化酶促動(dòng)力學(xué)過(guò)程中米氏常數(shù)進(jìn)行測(cè)定；再以DE值（還原糖含量）、透光率和蛋白質(zhì)含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行工藝優(yōu)選。

1.2.2.1 耐高溫淀粉酶用量考察 選取一個(gè)適宜的調(diào)漿和液化工藝條件，按表1，僅改變耐高溫淀粉酶（諾維信生物科技公司）的用量，選用DE值指標(biāo)進(jìn)行單因素11水平考察，優(yōu)選確定最佳酶用量。

表1 耐高溫淀粉酶用量考察水平表Table 1 The level table of the dosage investigation of high temperature resistant amylase

1.2.2.2 粉漿濃度考察 利用酶促動(dòng)力學(xué)反應(yīng)米氏方程考察粉漿濃度，即根據(jù)米氏常數(shù)的測(cè)定方法，選取一個(gè)適宜的調(diào)漿和液化工藝條件，并參考最佳酶用量，共進(jìn)行了8次液化實(shí)驗(yàn)，擬合方程測(cè)算其相關(guān)參數(shù)。

1.2.2.3 調(diào)漿與液化工藝正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)液化工藝的原理與實(shí)際情況，設(shè)定了粉碎度、粉漿濃度、液化時(shí)間、CaCl2用量等8個(gè)考察因素，每個(gè)因素設(shè)定三個(gè)水平（基于各影響因素的一般范圍），因素水平表見(jiàn)表2。并考察液化時(shí)間與酶用量的交互作用，采用L27（313）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）。

表2 L27（313）調(diào)漿與液化正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 The factors and level table of mixing and liquefaction orthogonal experimental L27（313）

1.2.3 糖化工藝研究 糖化工藝過(guò)程是碎米酶解制成注射用葡萄糖工藝中最關(guān)鍵的步驟，糖化過(guò)程主要生成單糖這類小分子糖類，糖化完全與否是影響注射用葡萄糖純度的關(guān)鍵所在，其工藝參數(shù)的優(yōu)化至關(guān)重要，有參考文獻(xiàn)對(duì)酶用量、糖液化時(shí)間、pH、溫度等因素對(duì)糖化工藝的影響進(jìn)行了考察[11-12]，本文以葡萄糖百分含量，DE值和透光率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行工藝優(yōu)選。

根據(jù)糖化過(guò)程的基本原理，設(shè)定了糖化酶類型、糖化酶用量、普魯蘭酶用量、糖化時(shí)間、pH和溫度這6個(gè)考察因素，以葡萄糖百分含量，DE值（還原糖含量）和透光率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行工藝優(yōu)選。每個(gè)因素設(shè)定三個(gè)水平（基于各影響因素的一般范圍），因素水平表見(jiàn)表3。并考察糖化酶用量與pH和普魯蘭酶用量與pH的交互作用，采用L27（313）正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表3）。

表3 L27（313）糖化正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 3 The factors and levels table of saccharification orthogonal experimental L27（313）

2 結(jié)果與分析

2.1 碎米預(yù)處理工藝研究結(jié)果與分析

用滴定法測(cè)得本批碎米原料中淀粉的百分含量為59.4%；用凱氏定氮法測(cè)得蛋白質(zhì)的百分含量為6.51%。結(jié)果表明，該批碎米基本符合食品要求。在碎米原料的磨漿工藝考察中用凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果列于表4。

表4 前處理工藝蛋白質(zhì)含量（%）測(cè)定結(jié)果表Table 4 Results of protein content（%）determination before process

根據(jù)方差分析可得出粉碎度（F=5.869＞F0.05（2，8）=4.46，p＜0.05）為影響前處理工藝的主要因素，而浸泡時(shí)間的三水平之間差異無(wú)顯著性意義，故浸泡時(shí)間的最佳水平是通過(guò)對(duì)浸泡時(shí)間各水平指標(biāo)平均值比較得出，浸泡時(shí)間為4h時(shí)蛋白質(zhì)含量最?。?.048%）。綜合粉碎度和浸泡時(shí)間各水平的指標(biāo)平均值，得出粉碎度為100目，浸泡時(shí)間為4h時(shí)的蛋白質(zhì)含量最小。但是粉碎度對(duì)后續(xù)的液化工藝影響較大，暫不能確定為100目，綜合考慮后確定為60～80目為宜。

2.2 液化工藝研究

2.2.1 酶用量考察結(jié)果及分析 各水平酶用量的液化液DE值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 耐高溫淀粉酶用量與DE值的關(guān)系Fig.1 The diagram of high temperature resistant amylase dosage and DE value

由圖1可知，當(dāng)酶的用量低于160U·g-1時(shí)，DE值隨著酶用量的增加而升高，當(dāng)酶的用量大于160U·g-1后，DE值基本不變，這說(shuō)明在酶用量達(dá)到160U·g-1時(shí)，碎米已經(jīng)基本液化完全，底物已消耗完，故再增加酶的用量DE值已不再變化。因此可以確定160U·g-1為液化的最佳酶用量。

表5 液化酶動(dòng)學(xué)米氏常數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 5 The measurement results of liquefied enzyme dynamics Michaelis constant

2.2.2 粉漿濃度考察結(jié)果及分析 液化工藝的粉漿濃度考察利用酶促動(dòng)力學(xué)反應(yīng)米氏方程展開(kāi)測(cè)定研究。根據(jù)米氏常數(shù)的測(cè)定方法，共進(jìn)行了8次液化實(shí)驗(yàn)，各次實(shí)驗(yàn)的碎米取樣量為2100.0g，各次實(shí)驗(yàn)的工藝條件同2.2.1工藝條件，其測(cè)定結(jié)果見(jiàn)列于表5。

表6 液化工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 The orthogonal experimental results of liquefaction craft

根據(jù)表5可知，當(dāng)酶用量相同的情況下，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的液化過(guò)程的酶動(dòng)學(xué)米氏方程的米氏常數(shù)Km由5.714%～7.808%（p＜0.05），其余不同工藝參數(shù)的米氏方程的p值均大于0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而液化過(guò)程的Km由5.714%～7.808%，所對(duì)應(yīng)的粉漿濃度范圍擴(kuò)大為20%～30%。

2.2.3 調(diào)漿與液化工藝結(jié)果及分析 將各正交實(shí)驗(yàn)號(hào)的樣品依據(jù)各項(xiàng)測(cè)得方法進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。

對(duì)表6的結(jié)果進(jìn)行方差分析（見(jiàn)表7），由表7方差分析結(jié)果可知，影響碎米液化工藝的主要因素為D（CaCl2用量）和G（pH），且D＞G。而其他因素的各水平間差異無(wú)顯著性意義。綜合直觀分析和方差分析的結(jié)果，根據(jù)方差分析的結(jié)果，影響碎米液化工藝的主要因素為D（CaCl2用量）和G（pH），其余因素的各水平均無(wú)顯著性差異，因此D、G因素的最佳工藝水平取K值最大的水平，即D3G2，而其余各因素的工藝水平是綜合考慮各水平K值大小和成本控制等實(shí)際情況來(lái)確定最佳水平。可得液化最佳工藝為A2B2C2D3G2H1，即碎米粉碎度為60目，粉漿濃度25%～30%，液化時(shí)間30min，CaCl2用量為0.3%，pH為6.0，溫度為90～95℃，而酶類型E考慮成本，選擇編號(hào)為003的酶；酶用量F結(jié)合前面的酶用量考察，確定為160U/g。

將得出的A2B2C2D3G2H1工藝條件重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程，測(cè)得其DE值、蛋白質(zhì)含量及透光率分別為30.89%、0.2314%、98.8%，綜合評(píng)分為176.5。

表7 液化工藝正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 7 The results of analysis of variance in liquefaction orthogonal test

2.3 糖化工藝研究

2.3.1 糖化工藝的底物濃度考察結(jié)果及分析 采用經(jīng)典的糖化酶促動(dòng)力學(xué)米氏方程數(shù)學(xué)模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其原理與方法同2.2，其工藝條件及結(jié)果分別列于表8和表9。

表8 糖化工藝酶促動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的工藝條件Table 8 The test process conditions of saccharification process enzyme kinetics

從表9可知，糖化過(guò)程的Km由31.46%～133.7%，因此液化后干物質(zhì)的濃度的范圍擴(kuò)大為85%～95%。

2.3.2 糖化工藝研究結(jié)果及分析 各取液化液200mL，用鹽酸調(diào)pH至4.0～4.5，同時(shí)升溫至50～70℃，然后按量加入不同廠家的糖化酶和普魯蘭酶，此溫度下保溫24～32h后，用乙醇檢測(cè)糊精反應(yīng)，將其pH調(diào)至4.8～5.0，同時(shí)加熱到80℃，保溫20min滅酶，然后將料液溫度降至60～70℃時(shí)開(kāi)始過(guò)濾。過(guò)濾后進(jìn)行測(cè)定，其測(cè)定結(jié)果列于表10。

同表7將結(jié)果進(jìn)行方差分析，由方差分析可知，影響碎米制葡萄糖的糖化工藝的主要因素為F（溫度，p＜0.01），且普魯蘭酶用量（C）與pH（E）的交互作用必須考慮（p＜0.05）。而其他因素的各水平間差異無(wú)顯著性意義。

綜合上述分析的結(jié)果，根據(jù)選擇各因素K值最大的水平即可得糖化最佳工藝為A3B3C3D1E2F2，即糖化酶類型為鴻鷹祥，糖化酶用量為150U/g干物質(zhì)，普魯蘭酶用量為0.25U/g干物質(zhì)，糖化時(shí)間為24h，pH為4.2，溫度為60℃。

經(jīng)驗(yàn)證，按得出的最佳工藝條件A3B3C3D1E2F2按上述過(guò)程進(jìn)行糖化液化實(shí)驗(yàn)，測(cè)得其葡萄糖含量、DE值及透光率分別為116.8%、89.87%、38.6%，綜合評(píng)分為287.5，所得結(jié)果滿意。

3 結(jié)論與討論

目前，以玉米為原料制成注射用葡萄糖的工藝已相當(dāng)成熟。用大米為原料的工藝研究國(guó)內(nèi)外許多專家已經(jīng)開(kāi)展了大量的工作，也取得了顯著性成果。然碎米不同于玉米，也有別于大米。由于碎米中含有糠雜、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)成分，用現(xiàn)有的玉米或大米工藝是無(wú)法實(shí)現(xiàn)制得達(dá)標(biāo)的注射用葡萄糖。為此本文開(kāi)展相關(guān)研究。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)得出了液化、糖化的最佳工藝條件，為注射用葡萄糖的新原料開(kāi)辟了新的途徑。

同于玉米，以碎米為原料也是用雙酶法制成注射用葡萄糖，其水解包括液化和糖化兩個(gè)過(guò)程。液化工藝過(guò)程主要是碎米淀粉糊化的過(guò)程，包括淀粉糊化的物理過(guò)程，以硬糊化淀粉糊精化的化學(xué)過(guò)程。主要生成低聚糖等糖類分子，液化工藝好壞直接影響到后續(xù)的糖化過(guò)程。糖化是將糊精徹底水解為葡萄糖。糊化、糖化不完全所遺留的淀粉，在后步不會(huì)轉(zhuǎn)化，易在產(chǎn)品中產(chǎn)生“小白點(diǎn)”，是帶來(lái)注射糖質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)的最重要原因[13-14]，因此液化糖化工藝甚為重要。

表9 糖化工藝酶促動(dòng)力學(xué)米氏常數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 9 The results of saccharification process enzyme kinetics

本文對(duì)碎米酶解成注射用葡萄糖液化糖化工藝進(jìn)行了系統(tǒng)地研究，獲得了相應(yīng)的最佳工藝條件A3B3C3D1E2F2。此外，本課題組成員還發(fā)現(xiàn)，淀粉水解成葡萄糖過(guò)程中，淀粉粒的大小是影響糊化速度的一個(gè)重要因素，顆粒大容易糊化，顆粒小則不易糊化，不利于淀粉的水解；稻米淀粉的結(jié)構(gòu)也是影響其液化效果的一個(gè)不容忽視的因素；區(qū)別于玉米、大米，碎米所含的米糠、稻殼比較多，故而蛋白質(zhì)與農(nóng)殘的含量比較高，因此，在以碎米制葡萄糖時(shí)，首先要檢測(cè)控制農(nóng)藥殘留量，將農(nóng)殘超標(biāo)的批次剔除；再者，還需將蛋白質(zhì)先行除去，才能保證制得的葡萄糖質(zhì)量。然而，稻米中所含的蛋白質(zhì)網(wǎng)組織緊密、分離困難，使液化難以徹底，繼而導(dǎo)致糖化不完全，這些都是碎米原料制成注射用葡萄的難點(diǎn)。

表10 糖化工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 10 The results of liquefaction orthogonal test

綜上所述，采用雙酶法以碎米為原料制成注射用葡萄糖，制備工藝研究時(shí)首先需建立葡萄糖、有機(jī)磷、氯農(nóng)藥、擬除蟲(chóng)菊酯、黃曲霉素等HPLC、GC含測(cè)監(jiān)控方法，然后做到四要：a.要使糊化、糖化完全；b.要精制除雜徹底；c.要建立糊精的除去工藝和臨控方法；d.要防止微生物的污染與熱原除去[15]。

[1]張郁松，王憲偉.酶法制取葡萄糖的工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2006，27（11）：122-123.

[2]李展文.山東A集團(tuán)年產(chǎn)6萬(wàn)噸結(jié)晶葡萄糖項(xiàng)目財(cái)務(wù)可行性研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2009.

[3]石桂春.美國(guó)玉米加工業(yè)的歷史與現(xiàn)狀[J].玉米科學(xué)，2001，9（2）：83-84.

[4]張力田.果糖產(chǎn)品的發(fā)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1997，23（2）：57-69.

[5]Mayer F C，Larner J.Substrate cleavage point of the α-and β-amylases[J].Am Chem Soc，1959，81：188-193.

[6]Fukumoto J，Yamamoto T，Ichikawa K.Proc Fructose production[J].Jap Acad，1915，27：352-358.

[7]Wellk N E，Campell L L.Effect of carbin sourses on formation of α-amylase by bacillus stearothermophilus[J].Bact，1963，86：681-686.

[8]PazurJH，Knull H R，CepurA.Glycoenzymes：Structure and properties of the two for ms of glucoamylase from Aspergillus niger[J].Carbohydr Rer，1971，20：83-96.

[9]劉佐才，候平然.酶法生產(chǎn)果葡糖漿的發(fā)展[J].冷飲與速凍食品，2001（9）：39-41.

[10]陳三寶.粗淀粉酶酸法生產(chǎn)液體葡萄糖新工藝的研究[J].西部糧油科技，1998（3）：29-32.

[11]姜宗贛，徐邁.雙酶法葡萄糖的生產(chǎn)與應(yīng)用[J].淀粉與淀粉糖，1996（3）：34-35.

[12]孫鵬.玉米制取葡萄糖的酶法工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技2006，22（1）：89-90.

[13]高玉臣.大米制造葡萄糖的技術(shù)和工藝[J].杭州食品科技2008（2）：23-25.

[14]王曉琳，張澄洪，歐陽(yáng)平凱.應(yīng)用納濾膜分離糖和鹽的實(shí)驗(yàn)研究[J].膜科學(xué)與技術(shù)，2001，12（1）：44-48.

[15]賀福元，鄧凱文，劉文龍，等.葡萄糖應(yīng)用生產(chǎn)現(xiàn)狀及碎（大）米酶法制成注射用葡萄糖的巨大優(yōu)勢(shì)[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010（12）：68-71.