免疫親和柱凈化-高效液相色譜法測定乳粉中游離葉酸含量

陶大利，姜金斗，*，張永勝

（1.農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，黑龍江哈爾濱150090；2.北京博歐實(shí)德生物技術(shù)有限公司，北京100107）

葉酸（FA）是一種重要的B族維生素，是人和動物為維持正常的生理功能而必須從食物中獲得供給的微量有機(jī)物質(zhì)，國際上規(guī)定葉酸的日攝入量（RDA）為3mg/kg體重。葉酸缺乏會引起巨幼紅細(xì)胞貧血、高同型半胱氨酸血癥，后者被認(rèn)為是心血管疾病的獨(dú)立危險因素[1]。我國在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了嬰幼兒配方奶粉與調(diào)制乳粉中強(qiáng)化葉酸的量為嬰幼兒配方乳粉一般為500～2500μg/kg[2]；兒童用乳粉420～3000μg/kg；孕產(chǎn)婦用乳粉2000～8200μg/kg；其他調(diào)制乳粉為2000～5000μg/kg[3]。由于目前國標(biāo)中采用的微生物法[4]測定技術(shù)存在難度大、周期長等問題，建立簡單、快速、準(zhǔn)確的測定乳粉中葉酸含量的方法有重要現(xiàn)實(shí)意義。葉酸分析的主要方法有分光光度法、液相色譜法、微生物法等[5-9]。分光光度法用于葉酸含量較高的藥物測定。液相色譜法測定食品或保健品中葉酸一般采用柱后衍生的方法[10-13]，即使采用固相萃取技術(shù)凈化[14]，對乳粉類樣品而言，也因固相萃取凈化后的樣液中部分干擾物質(zhì)不能有效去除而干擾葉酸的定量測定。2010年發(fā)布的乳品標(biāo)準(zhǔn)微生物法也因測定周期長、技術(shù)難度大、重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)，只有極少數(shù)質(zhì)檢機(jī)構(gòu)采用。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用在食品中葉酸測定中已有報道[15]，雖靈敏度高于液相色譜法，但回收率也不理想。而近年來免疫親和凈化技術(shù)對處理復(fù)雜基質(zhì)的樣品用于儀器分析的優(yōu)勢越來越明顯[16-18]。本實(shí)驗(yàn)擬以葉酸免疫親和柱凈化、己烷磺酸鈉為離子對試劑，無需柱后衍生，建立了反相高效液相色譜法測定乳粉中葉酸含量的方法。其中將免疫親和柱凈化用液相色譜分析用于乳粉樣品中葉酸測定是一個創(chuàng)新，目前文獻(xiàn)中還未見有類似的報道。此方法可以滿足乳品企業(yè)出廠檢驗(yàn)與品控及質(zhì)監(jiān)部門監(jiān)督的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇 色譜純；pH7.4磷酸鹽緩沖液 分別稱取1.24g KH2PO4（分析純）、7.27g K2HPO4（分析純）和8.76g NaCl（分析純）溶解于1L去離子水中，調(diào)pH至7.4；離子對-醋酸溶液 稱取20mg己烷磺酸鈉，吸取10mL冰乙酸、1.3mL三乙胺后定容至1L，用磷酸調(diào)到pH3.2，用0.45μm濾膜過濾；葉酸標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于98%） 美國Sigma公司；Biotez葉酸免疫親和柱美國Biotez公司，柱容量為500ng葉酸。

2695型高效液相色譜儀、2489型雙通道紫外檢測器 美國Waters公司；3-30K型高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；SPE型固相萃取裝置 美國Supelco公司；N-EVAP112型氮吹儀 美國Organomation公司。

1.2 樣品處理

1.2.1 樣品提取 稱取樣品2g（精確至0.1mg）置于錐形瓶中，用pH7.4磷酸鹽緩沖液50mL溶解樣品后，超聲提取10min。將樣液移入50mL離心管中以5000r/min離心10min，去除上層脂肪后取10mL置于錐形瓶中加入30mL pH7.4磷酸鹽緩沖液混勻。

1.2.2 免疫親和柱凈化與富集 將免疫親和柱置于固相萃取裝置上，放出柱中的保存液后將40mL樣液以不超過2mL/min的速度全部通過小柱后排空，再用20mL pH7.4磷酸鹽緩沖液沖洗小柱并抽干殘存的洗滌液。將樣品收集瓶放于小柱下方后向小柱中加入1mL甲醇，待甲醇到達(dá)小柱底部后關(guān)閉活塞靜止1min，然后再加入2mL甲醇以不超過2mL/min的速度全部通過小柱，并排干小柱中的殘留液體。將洗脫液用氮吹儀吹至近干后取下，再用去離子水定容至2mL，通過0.45μm濾膜。

1.3 色譜條件

色譜柱：Waters C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫：35℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：100μL；流動相：離子對-醋酸溶液：甲醇（80∶20，V/V）。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理的優(yōu)化

由于嬰幼兒乳粉及調(diào)制乳粉中成分復(fù)雜，蛋白質(zhì)及脂肪含量較高，干擾物質(zhì)較多等，為防止蛋白質(zhì)等對免疫親和柱凈化時產(chǎn)生干擾，采用了高氯酸、亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液、硫酸鋅溶液及調(diào)pH4.6四種沉淀蛋白的方法。由于免疫親和柱適宜的pH為7.4左右，為此將上述過濾液分別將酸度調(diào)至pH7.4后過柱。通過進(jìn)行回收率的測定后發(fā)現(xiàn)，上述四種方法葉酸的回收率都在65%以下，證明這四種處理方法都不可行。究其原因可能是由于在蛋白沉淀過程中部分葉酸被蛋白質(zhì)吸附或包裹造成損失及樣液酸堿體系不穩(wěn)定影響與抗體的結(jié)合等所致。為此根據(jù)免疫親和柱的特點(diǎn)，我們采用緩沖溶液使樣液的酸度穩(wěn)定在適宜范圍；其次根據(jù)專一性強(qiáng)、不對蛋白吸附的特點(diǎn)在不去除蛋白質(zhì)的情況下直接過柱凈化。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，若樣液不去除脂肪，由于脂肪對抗體表面的掩蓋作用會造成結(jié)果偏低；若通過離心去除脂肪后的樣液直接過柱，也會因樣液較為粘稠造成堵塞而難以過柱；而通過樣液與緩沖溶液1∶3稀釋后再過柱即可以解決堵塞問題，也可解決脂肪對葉酸與抗體結(jié)合的影響。通過回收及樣品測定后證明，此處理方法樣品回收率達(dá)90%左右，樣品實(shí)際測定值符合基本實(shí)際添加量，其精密度較好。

2.2 免疫親和柱性能的測定

為驗(yàn)證免疫親和柱的性能，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了不同上樣量、不同吸附洗脫的速度測試，通過測定回收率進(jìn)行了最佳凈化條件的考察。首先采用含有300ng的標(biāo)準(zhǔn)葉酸溶液按1、2、3、4、5mL/min吸附、洗脫相同的速度進(jìn)行測試，證明當(dāng)流速高于2mL/min時其效果顯著下降；當(dāng)流速≥4mL/min時，回收率低于50%，說明流速過快對吸附洗脫效果影響顯著，見表1。之后選用不同上樣量以2mL/min的吸附洗脫速度測試的回收率均在97%以上，證明該免疫親和柱性能優(yōu)良，見表2。

表1 不同吸附洗脫速度對葉酸測定結(jié)果的影響Table 1 The effect of adsorption elution speed on folic content measurement

表2 葉酸免疫親和柱性能驗(yàn)證結(jié)果Table 2 The folic acid immunoaffinity column performance verification results

2.3 色譜條件的優(yōu)化

為達(dá)到分離效果好、基線噪聲低、靈敏度高的目的，根據(jù)文獻(xiàn)直接采用紫外檢測器280nm波長進(jìn)行檢測。本實(shí)驗(yàn)（除流動相外，色譜條件采用1.3）重點(diǎn)對4種流動相進(jìn)行了優(yōu)化：a.12%乙腈+88%0.05mmol/L磷酸二氫鉀溶液（pH=3.5）[5-6]；b.35mL乙腈+965mL 0.05mol/L KH2PO4緩沖鹽（pH=5.0）[7]；c.0.05mol/L KH2PO4-0.01mol/L四丁基溴化銨-乙腈（88∶2∶10，V/V），磷酸調(diào)節(jié)pH5.5[1]；d.（20mg己烷磺酸鈉+10mL冰乙酸+1.3mL三乙胺后定容至定容1L，pH3.2）：甲醇（80∶20，V/V）。實(shí)驗(yàn)表明，流動相a、b采用的是緩沖鹽，葉酸保留時間過長，與樣品中的雜質(zhì)不能有效分離；流動相c、d采用的是離子對分離模式，都可以分離葉酸（見圖1），但流動相d的分離效果稍好且保留時間在10min左右，樣品凈化后待測物附近無雜質(zhì)干擾、靈敏度高，故本實(shí)驗(yàn)的選擇流動相d，見圖2。

圖1 嬰兒配方奶粉中葉酸色譜圖（流動相c）Fig.1 Chromatograms of folic acid in infant formula milk powder（mobile phase c）

圖2 嬰兒配方奶粉中葉酸色譜圖（流動相d）Fig.2 Chromatograms of folic acid in infant formula milk powder（mobile phase d）

2.4 線性范圍與檢出限

在上述的最佳色譜條件下，根據(jù)乳粉中葉酸含量范圍及樣品處理方法，配制成葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液為50、100、150、200、300μg/L系列濃度，采用外標(biāo)峰面積法定量。經(jīng)測定，在該系列濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=-185.68+290.29x（y為峰面積；x為濃度，μg/L），相關(guān)系數(shù)R2=0.9997（見圖3）。用嬰兒配方奶粉樣品處理液測定峰面積，以本底3倍噪音計(jì)算樣品最低檢出限為40μg/kg。圖4為100ng/L濃度的葉酸標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖，由圖4中可看出，在低濃度時葉酸色譜圖的保留時間、峰形、峰高等參數(shù)都等滿足測定需要。

圖3 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Folic acid standard curve

圖4 葉酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.4 Folic acid standard chromatogram

2.5 方法的回收率和精密度

分別選取嬰兒配方奶粉與兒童奶粉添加葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行樣品處理，測定回收率；將嬰幼兒配方乳粉與兒童乳粉分別稱取6份按1.2方法處理后上機(jī)進(jìn)行精密度測定。兩樣品不同添加量回收率在84%～92%之間，平均為88.2%，兩個樣品平均RSD為1.99%。回收率與精密度測定結(jié)果分別見表3、表4。

表3 樣品中葉酸回收率測定結(jié)果Table 3 Recovery rates of folic acid measurement results

表4 樣品葉酸精密度測定結(jié)果Table 4 Determination precision（RSD）of folic acid in sample

由方法回收率與精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對于含有微量成分樣品的定量測定而言，回收率在80%以上完全能滿足定量測定的要求；同時精密度實(shí)驗(yàn)的RSD%優(yōu)于國標(biāo)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求（10%）[4]。此方法準(zhǔn)確、性重現(xiàn)性好。

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)建立了嬰幼兒配方乳粉與調(diào)制乳粉中葉酸的免疫親和柱凈化富集、高效液相色譜測定方法。該法具有樣品處理簡單、測定周期短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

3.2 通過對葉酸免疫親和柱性能的測試，吸附洗脫速度應(yīng)控制在2mL/min以內(nèi)；不同標(biāo)準(zhǔn)濃度葉酸回收率在97%～98%間，性能可靠。

3.3 通過對樣品前處理方法的優(yōu)化，確定了采用緩沖液處理、離心脫脂、免疫親和柱凈化及富集的方法，無需沉淀去除蛋白質(zhì)，從而解決了采用液相色譜法測定葉酸干擾而影響定量的問題。最低檢出限為40μg/kg。

3.4 該方法線性范圍好，在50～300μg/L的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為y=-185.68+290.29x，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。

3.5 樣品加標(biāo)回收率在84%～92%間，平均為88.2%；樣品6次測定結(jié)果RSD為1.39%，完全能滿足微量成分定量測定的要求。

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